其林貝爾分析誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的作用機制！

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI） 是由冠狀動脈發(fā)生急性血栓而誘發(fā)心肌細(xì)胞大量死 亡引起的惡性疾病，是人類心血管疾病的主要死因。 研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血20 min便可造成不可逆損傷，急 性心肌梗死后再灌注治療是目前減少心肌細(xì)胞死 亡、減少梗死面積的唯一有效治療手段。然而，心 肌組織缺血后再灌注恢復(fù)了心肌血供，同時也加重 了心肌組織的損傷和心臟功能紊亂，這種現(xiàn)象稱為 心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

12只3~4個月的健康雄性C57BL/6 小鼠購自上海南方模式生物科技股份有限公司； 依文思藍(lán)（Evan’s blue）、2，3，5-三苯基氯化四氮唑 （triphenyltetrazolium chloride，TTC）購自美國Sigma公 司；血清肌酸激酶（creatine kinase，CK）和肌鈣蛋白T （cardiac troponin T，cTnT）測定試劑盒購自南京建成 生物工程研究所；半胱天冬酶 3（Caspase 3）檢測試 劑盒購自美國BIOMOL公司；胎牛血清、青鏈霉素、 杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Hank’s液 均為美國Gibco公司產(chǎn)品；70 μm細(xì)胞過濾篩網(wǎng)購自 美國BD公司；抗鼠IL-17A、Caspase 3、Bax、Bcl-2、pAkt、Akt抗體、抗鼠GAPDH抗體、抗鼠或兔的辣根過 氧化物酶（horse reddish peroxidase，HRP）偶聯(lián)二抗 均為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；4%多聚 甲醛、放射免疫沉淀法（radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒購自碧云天公司；脫氧核糖核苷酸末 端 轉(zhuǎn) 移 酶 介 導(dǎo) 的 缺 口 末 端 標(biāo) 記 法（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP - biotin nick end labeling，TUNEL）凋亡檢測試劑盒購自美國 Roche公司；重組小鼠IL - 17A（rmIL-17A）：貨號 Q62386，購自美國R&D Systwm 公司。

1.2 小鼠心肌缺血再灌注損傷模型的建立

取健 康3~4個月雄性C57BL/6小鼠12只，隨機分為假手術(shù) （Sham）組和缺血再灌注（I/R）組，每組6只。用 40 mg/kg的4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，麻醉 后將其仰臥固定于鼠臺，經(jīng)口氣管插管后連接小動 物呼吸機維持呼吸。胸前區(qū)剃毛，并用酒精消毒，于 左側(cè)心尖搏動最明顯處分離皮膚與肌層，剪開3~5 肋骨，暴露心臟并找到左冠狀動脈前降支（left anterior descending，LAD），用8-0無損傷絲線于左心 耳下緣1~2 mm處穿過心肌表層結(jié)扎LAD，在結(jié)扎 LAD時內(nèi)墊PE-50聚乙烯管，行缺血實驗。缺血 45 min后，重新打開胸腔，打開線結(jié)移除PE-50管， 恢復(fù)供血。假手術(shù)組以相同方式手術(shù)，絲線僅從LAD 下方穿過，但不做結(jié)扎。

1.3 心肌梗死面積測定

小鼠心肌缺血45 min再灌 注3 h、24 h、72 h后打開胸腔，再次結(jié)扎LAD，自主動 脈注入1 ml 1% Evan’s blue染液，使相應(yīng)心肌著色， 非缺血心肌呈藍(lán)色，缺血區(qū)即危險區(qū)（area at risk， AAR）不染色。隨后處死小鼠取出心臟，用濾紙吸干 置于-20 ℃冰凍10 min，從心尖處橫向切成4片，每片 厚約1 mm，置于1% TTC磷酸緩沖液中37 ℃孵育 20 min，后用4%多聚甲醛固定過夜，此時梗死區(qū)呈 白色，非梗死區(qū)呈紅色。采用高分辨率解剖顯微鏡 對每片心肌組織進(jìn)行拍照，Image J軟件分別對各個 染色區(qū)域進(jìn)行定量，用梗死面積（infarct，I）與左心室 面積（left ventricle，LV）之比即梗死面積/危險區(qū) （infarct/area at risk，I/LV）和梗死面積（infarct，I）與危 險區(qū)（AAR）之比即梗死面積/危險區(qū)（infarct/area at risk，I/AAR）來反映梗死的情況。取出生1天的C57BL/6小 鼠，超凈臺中用75%乙醇浸泡消毒，無菌眼科剪取出 心臟，置于無菌Hank’s液中將心臟中血液沖洗干 凈，用眼科剪將心臟剪成1×1 mm小塊，移入新培養(yǎng) 皿并加入3 ml胰蛋白酶消化液，4 ℃搖床（購至海門市其林貝爾儀器）孵育30 min， 終止消化1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入3 ml的 Liberase TH酶37 ℃消化15 min，70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過 濾，將所得細(xì)胞懸液離心并用含20%胎牛血清的 DMEM重懸，移至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)60 min。此時，心臟 成纖維細(xì)胞貼壁，心肌細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，收集懸浮的 心肌細(xì)胞，移入新培養(yǎng)皿培養(yǎng)，72 h后待心肌細(xì)胞貼 壁并同步化跳動，則可用于后續(xù)實驗。

2 結(jié)果

小鼠經(jīng) LAD結(jié)扎45 min后再灌注3 h、24 h、72 h，采用Evan’s blue和TTC染色法染色發(fā)現(xiàn)，3 h、24 h和72 h均可見 缺血與梗死區(qū)，Sham組和I/R各個時間點的AAR/LV 之間相比均無統(tǒng)計學(xué)意義（46.3±4.1，45.2±4.6，46.9± 5.2，45.7±5.4；P>0.05），但I(xiàn)/R各個時間點的I/AAR較 Sham組顯著增加，且隨時間延長梗死面積逐漸擴大 （2.1±0.9，16.4±2.5，44.6±2.8，52.3±4.6；P<0.05）（圖 1a）。如圖1b和1c所示，I/R各個時間點血清肌酸激 酶（CK）和肌鈣蛋白T（cTnT）較Sham組顯著增加，且 隨著I / R 時間延長呈增加趨勢（346.53 ± 210.54， 2163.23±232.18，3174.28±526.45，3532.56±416.28； P<0.05和0.35±0.21，1.98±0.35，10.52±2.23，14.5±2.42； P<0.05），提示小鼠心肌損傷模型構(gòu)建成功。I/R后隨 著時間延長心肌組織中心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加且 各時間點心肌細(xì)胞凋亡率均明顯高于Sham組（P< 0.05）；同時本研究還發(fā)現(xiàn)Caspase 3活性亦隨著時間 逐漸增加，得到與TUNEL 染色一致的結(jié)果（P< 0.05）。為研究小 鼠I/R后心肌組織中高表達(dá)的 IL-17A 是否與心肌細(xì) 胞凋亡有關(guān)，本研究分離培養(yǎng)了小鼠原代心肌細(xì) 胞，并用10、20、40和80 ng/ml的IL-17A 分別處理細(xì) 胞24 h，TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，IL-17A 能呈劑量濃度依 賴地促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡（2.15 ± 0.65，11.25 ± 1.89， 16.78±2.56，24.16±4.61，38.96±5.16；P<0.05）。

3 討論

心肌I/R損傷導(dǎo)致氧自由基大量產(chǎn)生、細(xì)胞壞 死、血管損傷以及滲透性的增加，在此過程中多種免 疫反應(yīng)被激活并參與其中，各種細(xì)胞因子、免疫因子 相繼產(chǎn)生，參與心肌炎癥反應(yīng)加重心肌損傷。起初，介導(dǎo)免疫應(yīng)答的T細(xì)胞被認(rèn)為不參與心肌I/R損 傷，然而近年來大量研究推翻了這一觀點，CD4+ T細(xì) 胞參與了肝臟、腎臟、腦以及腸道I/R損傷。在心肌I/R中，CD3+ T細(xì)胞能夠在短時間內(nèi)浸潤至梗死區(qū)， T、B細(xì)胞缺陷小鼠I/R后梗死面積更小，而恢復(fù)CD4+ T細(xì)胞后則是I/R損傷加重，CD4+ T細(xì)胞也被認(rèn)為是IRI的主要損傷因素。