大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的抑制作用愿意分析！

腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多 發(fā)病，其中缺血性腦血管疾病所占比例較大，缺血 性腦血管 疾 病 的 發(fā) 病 率、致殘率和死亡率均比較 高。缺血性腦卒中引起腦損傷的機(jī)制比較復(fù)雜，神 經(jīng)元細(xì)胞凋亡在腦損傷的發(fā)生過程中具有重要作 用，在腦缺血早期，缺血區(qū)域的病理生理學(xué)變化主 要為神經(jīng)元壞死，在腦缺血后期缺血半暗帶出現(xiàn)的 神經(jīng)元死亡以細(xì)胞凋亡為主，神經(jīng)元壞死為不可逆 的，而神經(jīng)元凋亡受一些程序調(diào)控，對(duì)其進(jìn)行干預(yù) 可減少神 經(jīng) 元 凋 亡 的 發(fā) 生。ｐ３８絲裂 原 活 化 蛋 白 激 酶 （ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ， ｐ３８ＭＡＰＫ）信號(hào)通路在神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)控 作 用，ｐ３８ ＭＡＰＫ 信號(hào) 通 路 的 激 活 可 促 進(jìn)神經(jīng)元凋 亡，抑 制 ｐ３８ ＭＡＰＫ 信號(hào) 通 路 可 抑 制 神經(jīng)元凋亡，減輕腦組織損傷。

１ 材料與方法

１．１ 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器

健康清潔級(jí)雄 性ＳＤ大 鼠 １０２ 只，購自上海斯萊 克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公 司，動(dòng)物許可證號(hào)：ＳＣＸＫ （滬）２００７－０００５。丁苯 酞注射液 （石藥集團(tuán) 恩 必 普 藥 業(yè) 有 限 公 司，批 號(hào)： ６１８１５０４１１），蘇木素－伊紅 （ＨＥ）染色試劑盒和原 位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記 （ＴＵＮＥＬ）染色試劑盒等 （美 國 Ｇｉｂｃｏ公司），聚氰基丙烯酸正丁酯 （ＢＣＡ）試 劑盒、辣根過 氧 化 物 酶 （ＨＲＰ）標(biāo)記的山羊抗兔 抗體、肌動(dòng)蛋白 （β－ａｃｔｉｎ）抗體、兔抗大鼠激活型 ｃａｓｐａｓｅ－３ （ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ－３）單克 隆 抗 體、兔 抗 大鼠 Ｂ 淋 巴 細(xì) 胞 瘤－２ 基因 （Ｂｃｌ－２）單克 隆 抗 體、 兔抗大 鼠 Ｂｃｌ－２相關(guān) Ｘ 蛋 白 （Ｂａｘ）單克 隆 抗 體、 兔抗大 鼠 ｐ３８ 單克 隆 抗 體、兔 抗 大 鼠 磷 酸 化－ｐ３８ （ｐ－ｐ３８）單克隆抗體和兔抗大鼠絲裂原活化蛋白激 酶 （ＭＡＰＫ） 單 克 隆 抗 體 （美 國 Ｓｉｇｍａ 公 司 ）， ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ－３、Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２、ｐ３８ 和 ＭＡＰＫ 引 物設(shè)計(jì)與合成均由上海生物工程技術(shù)有限公司完 成。細(xì)胞 培 養(yǎng) 箱 （美 國 Ｔｈｅｒｍｏ公司），倒置 相 差 顯微鏡 （日本 Ｏｌｙｍｐｕｓ公司），脫色搖床 （海門市其林貝爾儀器制造有限公司），電泳儀 （美國 Ｂｉｏ－ Ｒａｄ公司）和定量 ＰＣＲ儀 （美國 ＡＢＩ公司）。

１．２ 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和缺血性腦卒中大鼠模型的建立

將１０２只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和丁 苯酞組，每組３４只。模型組和丁苯酞組大鼠建立 缺血性腦卒中大鼠模型 （采用改良Ｚｅａ－Ｌｏｎｇａ法制 備局灶性腦缺血大鼠模型）：各組大鼠麻醉成功后， 剪開額頂部皮膚，暴露左側(cè)半顱骨和顱骨前囟，采 用激光多普勒血流儀記錄大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈血流 情況，左側(cè)大腦中動(dòng)脈血流數(shù)值平穩(wěn)后將大鼠仰臥 位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，剪開頸部皮膚，暴露并分 離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈以及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng) 脈近心端及頸外動(dòng)脈，夾閉遠(yuǎn)端頸內(nèi)動(dòng)脈，距頸內(nèi) 動(dòng)脈分叉１ｃｍ 處剪一切口，將尼龍線 （頭端涂上 硅膠）自左側(cè)頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈至感到少許阻 力，線栓到達(dá)大腦中動(dòng)脈分叉處，栓塞成功的標(biāo)準(zhǔn) 為血流儀顯示大腦中動(dòng)脈血流 下 降 至 基 礎(chǔ) 值 的 ２０％～３０％，栓 塞 成 功 后 固 定 線 栓，縫 合 傷 口， ２ｈ 回抽線栓恢復(fù)再灌注，大鼠模型制備完成。假 手術(shù)組大鼠不結(jié)扎和插線頸總動(dòng)脈近心端及頸外動(dòng) 脈，其他手術(shù)步驟同模型組。建模成功的標(biāo)準(zhǔn)：大 鼠提尾懸空實(shí)驗(yàn)陽性、向?qū)?cè)轉(zhuǎn)彎、同側(cè)眼裂減小 和對(duì)側(cè)肢體癱瘓。建模成功后，丁苯酞組大鼠腹腔注射丁苯酞注 射液 （４．５ｍｇ·ｋｇ－１），每天１次，假手術(shù)組和模 型組大鼠每天相同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量生理鹽水， 共２周。

１．３ 組織標(biāo)本處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，假手術(shù)組大鼠 均存 活； 丁 苯 酞 組 大 鼠 死 亡 ２ 只， 予 以 剔 除， ３２只納入研究；模 型 組 大 鼠 建 模 失 敗 １只，死 亡 １只，予 以 剔 除，３２ 只 納 入 研 究。 假 手 術(shù) 組 取 １７只大鼠，模型組和丁苯酞組各取１６只大鼠經(jīng)心 臟灌注多聚甲醛固定液后取腦，腦組織經(jīng)固定、脫 水、石蠟 包 埋，用 于 ＨＥ 染 色 和 ＴＵＮＥＬ 染 色； 假 手 術(shù) 組 取 １７ 只 大 鼠，模型組和丁苯酞組各取 １６只大 鼠 斷 頭 取 腦， 液氮速凍后保存， 用 于 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法和 ＲＴ－ＰＣＲ法檢測(cè)。

１．４ 大鼠海馬

ＣＡ１區(qū) ＨＥ 染色 將 各 組 大 鼠 石 蠟包埋海馬組織切成厚度５μｍ 的切片，進(jìn)行常規(guī) ＨＥ染色，顯微鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化，選擇 海馬 ＣＡ１區(qū)明 顯 的 層 面，４００倍高 倍 視 野 下 觀 察 細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)，計(jì)算每個(gè)高倍視野中殘留神經(jīng)元數(shù) 量。

１．５ 大鼠海馬

ＣＡ１區(qū)神經(jīng)元 ＴＵＮＥＬ 染色 將 各大鼠石蠟包埋海馬組織切片脫蠟至水，加入雙氧 水孵育４０ｍｉｎ以消除內(nèi)源性過 氧 化 酶 活 性，加 入 蛋白酶 Ｋ 孵 育１０ｍｉｎ，ＴＵＮＥＬ 反應(yīng) 液 孵 育１ｈ， ＰＯＤ－轉(zhuǎn)化液孵育３０ｍｉｎ，ＤＡＢ顯色１０ｍｉｎ，蘇木 素復(fù)染，脫水、透 明、封 片，高 倍 顯 微 鏡（×４００） 下觀察 ＴＵＮＥＬ染色情況，ＴＵＮＥＬ陽性細(xì)胞為細(xì) 胞核 固 縮 并 被 染 成 黃 褐 色 或 棕 黃 色，計(jì) 算 海 馬 ＣＡ１ 區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)。 神 經(jīng) 元 凋 亡 指 數(shù) ＝ ＴＵＮＥＬ染色陽性的神經(jīng)元／總神經(jīng)元×１００％。

１．６ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法檢測(cè)

各組大鼠海馬組織中 ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２、ｐ３８、ｐ－ｐ３８ 和 ＭＡＰＫ 蛋白表達(dá)水平 將各組大鼠海馬組織放入 ＥＰ管中，加入蛋白裂解液研磨均勻，提取海馬組 織總蛋 白，采 用 ＢＣＡ 法測(cè) 定 海 馬 組 織 蛋 白 濃 度， 采用 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 法 測(cè) 定 大 鼠 海 馬 組 織 中 ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２、ｐ３８、ｐ－ｐ３８ 和 ＭＡＰＫ 蛋 白 表 達(dá) 水 平， 以 兔 抗 大 鼠 ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３單克隆抗體、兔抗大鼠 Ｂａｘ單克隆抗體、 兔抗大鼠 Ｂｃｌ－２單克隆抗體、兔抗大鼠 ｐ－ｐ３８單克 隆抗 體、兔 抗 大 鼠 ｐ３８ 單克隆抗體和 兔抗大鼠 ＭＡＰＫ 單克隆抗體為一抗，以β－ａｃｔｉｎ為內(nèi)參，山 羊抗兔抗體 （ＨＲＰ標(biāo)記）為 二 抗。目 標(biāo) 蛋 白 的 相 對(duì)表達(dá)水平＝目標(biāo)蛋白條帶灰度值／β－ａｃｔｉｎ條帶灰度值。

２ 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)過程中假手術(shù)組大 鼠無死亡，丁苯酞組大鼠死亡２只，模型組大鼠建 模失?。敝?、死亡１只，予以排除。各 組 大 鼠 海 馬 ＣＡ１ 區(qū) ＨＥ染色結(jié)果：假手 術(shù) 組 大 鼠 海 馬 ＣＡ１區(qū)神 經(jīng) 元細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，細(xì)胞膜完 整；模型組大鼠海馬 ＣＡ１區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂， 細(xì)胞腫 脹 破 裂，細(xì) 胞 核 固 縮；丁苯酞組大鼠海馬 ＣＡ１區(qū)部分神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，排列尚完整， 細(xì)胞膜基 本 完 整。各組 大 鼠 海 馬 ＣＡ１區(qū)神經(jīng)元 ＴＵＮＥＬ 染色 結(jié) 果：假 手 術(shù) 組 大 鼠海 馬 ＣＡ１ 區(qū)基 本 無 ＴＵＮＥＬ 染色 陽 性 神 經(jīng) 元； 模型組大鼠海馬 ＣＡ１區(qū)可見大量 ＴＵＮＥＬ 染色 陽性神經(jīng)元，神經(jīng)元胞體縮小，細(xì)胞核固縮崩解，呈 黃褐色或棕黃色顆粒；丁 苯 酞 組 大 鼠 海 馬 ＣＡ１區(qū) 見少量 ＴＵＮＥＬ 染 色 陽 性 神 經(jīng) 元。與 假 手 術(shù)組 比 較，模型組和丁苯酞組大鼠海馬組織中 ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ－３、Ｂａｘ 和 ＭＡＰＫ ｍＲＮＡ 表 達(dá) 水 平明顯升高 （Ｐ＜０．０１），Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ 表達(dá)水平明 顯降低 （Ｐ＜０．０１）；與模 型 組 比 較，丁 苯 酞 組 大 鼠 海 馬 組 織 中 ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３、 Ｂａｘ 和 ＭＡＰＫ ｍＲＮＡ表達(dá)水平明顯 降 低 （Ｐ ＜０．０１）， Ｂｃｌ－２ ｍＲＮＡ 表 達(dá) 水 平 明 顯 升 高 （Ｐ ＜０．０１）。

3 討 論

細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)和調(diào)控比較復(fù)雜，ｃａｓｐａｓｅｓ為 凋亡的 最 后 執(zhí) 行 因 子，凋亡的實(shí)施通過 ｃａｓｐａｓｅｓ 的激活而 完 成 的，ｃａｓｐａｓｅ－３為ｃａｓｐａｓｅｓ級(jí)聯(lián) 反 應(yīng) 下游的關(guān) 鍵 因 子，在 凋 亡 程 序 的 啟 動(dòng) 中 起 樞 紐 作 用，ｃａｓｐａｓｅ－３可水解脫氧核糖核酸酶的抑制蛋白， 使脫氧核糖核酸酶活化進(jìn)入細(xì)胞核、使 ＤＮＡ 斷裂 從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；ｃａｓｐａｓｅ－３還可裂解 Ｂｃｌ－２，使 其失去活性從而發(fā)揮促凋亡作用；腦缺血可通過多 種途徑激活ｃａｓｐａｓｅ－３，進(jìn)而引起神經(jīng)元凋亡。 Ｂｃｌ－２為一種癌基因，對(duì)細(xì)胞凋亡具有抑制作 用；Ｂａｘ為 Ｂｃｌ－２家族成員 之 一，是 人 體 重 要 的 凋亡基因，可 與 Ｂｃｌ－２形成 二 聚 體 而 對(duì) Ｂｃｌ－２產(chǎn)生 抑制作用。Ｂａｘ和 Ｂｃｌ－２間的平衡關(guān) 系 對(duì) 細(xì) 胞 凋 亡具有調(diào)控作用，腦缺血時(shí)腦組織中 Ｂａｘ和 Ｂｃｌ－２ 平衡失 調(diào)，Ｂａｘ水平 升 高、Ｂｃｌ－２水平 降 低，從 而 引起神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。 丁苯酞是治療腦梗死的Ⅰ類新藥，對(duì)缺血性腦 梗死的治療效果比較顯著，可通過多個(gè)環(huán)節(jié)阻斷缺 血性腦損傷，其機(jī) 制 可 能 通 過 重 構(gòu) 缺 血 區(qū) 域 微 循環(huán)、調(diào) 節(jié) 缺 血 區(qū) 域 血 流 量，增 加 腦 組 織 能 量 代 謝，減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腦損 傷 的 修 復(fù)， 但丁苯酞對(duì)缺血性腦梗死的腦保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚。