人乳頭瘤病毒感染者狀況分析（離心機使用）

人乳頭瘤病毒( HPV) 是目前被確定的可引起宮 頸癌的病因。所以控制 HPV 感染可以有效控制宮頸 癌的發(fā)生。人類的皮膚黏膜是其天然宿主，皮膚和 黏膜的破損是 HPV 感染的啟動條件，HPV 病毒通過 受損的上皮組織進入基底層細胞，在細胞內(nèi)復制繁殖， 其復制周期受到嚴格的調(diào)控，并依賴于病毒編碼的蛋 白質(zhì)和宿主上皮細胞的分化程度。皮膚和黏膜是 預防 HPV 感染的第一道屏障，任何影響和破壞這道屏 障的因素都可以誘發(fā) HPV 的感染。陰道微環(huán)境是黏 膜屏障新陳代謝的基礎，所以陰道微環(huán)境與 HPV 的感 染有很密切的關系。

1 資料與方法

1． 1 一般資料

2017 年 3 月至 2018 年 3 月在我院自 愿進行 HPV 基因分型檢測的 462 例女性患者，年齡 20 ～ 82 歲，其中 30 ～ 50 歲女性最多。嚴格按照試劑說明 書或微生物采集手冊采集方法及注意事項采集，運送 及貯存標本。采用 PCＲ-反向點雜交技術檢測 HPVDNA 的分型情況，使用陰道炎聯(lián)檢試劑盒( 化學反應 法) 檢測陰道微生態(tài)情況。

1． 2 儀 器

與 試 劑 HPV 分型基因測試盒和 ABI StepOnePlus 基因擴增儀均由艾康生物科技有限公司 提供; 分子雜交儀購自興化市分析儀器廠; 臺式高速冷 凍離心機來自湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司; 式恒溫器，微型混合器，微型離心機均來自海門市其林貝爾儀器制造有限公司，移液器由賽默飛世爾儀器有限公 司提供。

1． 3 方法

1． 3． 1 樣本采集及保存

先按照陰道炎聯(lián)檢試劑盒使 用說明書標本采集要求，采集白帶標本。再由醫(yī)生以 擴陰器暴露宮頸口，先用棉拭子將宮頸口過多的分泌 物擦去，檢測標本為宮頸黏膜上皮細胞，最好為鱗-柱 交界處的上皮細胞。取柔軟的宮頸刷伸入宮頸，通過 鱗-柱交界處，直到看不到刷子頭，旋轉(zhuǎn) 10 ～ 20 s，取 出，將其放入細胞保存液中，密閉送檢，并注明惟一編 號，將兩份標本同時盡快送檢。

1． 3． 2 陰道炎聯(lián)檢試劑盒檢測檢測方法及結(jié)果判讀

將沾有標本的拭子取出，置于反應管中加 6 滴標本提 取夜，反復擠壓棉簽使樣本溢出。將溢出標本液滴于 測試卡的孔位于 35 ～ 37℃溫育 15 min，然后在 β-N-乙 酰氨基酸葡萄糖苷酶( NAG) 和唾液酸酐酶( SNA) 滴 加一滴顯色夜，2 min 后立即判讀結(jié)果。過氧化氫酶 H2O2 顯示紫紅色為陰性，提示正常，不顯色表示陽性， 提示菌群失調(diào); 白細胞酯酶( LE) 不顯色表示陰性，提 示正常; 顯藍色或綠色表示陽性，提示有炎癥; PH 值 ＞ 4． 5 為異常，有利于致病菌侵入及生長; β-葡聚糖醛 苷酸酶( GUS) 不顯色表示陰性，提示正常; 顯藍色或綠 色表示陽性，提示有大腸埃希菌等需氧菌感染; 唾液酸 酐酶( SNA) 不顯色或顯黃色表示陰性，提示正常; 顯藍 色或綠色表示陽性，提示有細菌性陰道病; β-N-乙酰氨 基酸葡萄糖苷酶( NAG) 不顯色表示陰性，提示正常; 顯黃色表示陽性，提示陰道保護性黏膜蛋白屏障被破 壞，陰道黏膜處于易感狀態(tài)或已被白色念珠菌等微生 物感染。

1． 3． 3 HPV-DNA 的提取及擴增

取出保存的標本平 衡室溫 1 ～ 2 h，對標本和對應 1． 5 ml 離心管管進行惟 一編號，震蕩混勻標本，取 1 ml 混懸液于已編碼的 1． 5 ml離心管中12 000 r/min 離心10 min，去上清液加 50 μl 核酸提取液，100℃干浴器10 min 后12 000 r/min 離 心 10 min，取 5 μl 核酸提取液加入 45 μl 的核酸反應 液，擴增產(chǎn)物如不能立即使用，密封放于 － 20℃冰箱保 存?zhèn)溆谩U增時間設定為: 50℃ 2 min; 95℃ 15 min; 94℃ 30 s，45℃ 1 min，72℃ 30 s，進行 50 個循環(huán); 72℃ 延伸 10 min。

1． 3． 4 雜交、洗膜和顯色

按照雜交液試劑配置說明 新鮮配置溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、結(jié)合液和顯色液。 雜交: 將 5 ml 溶液Ⅰ加入到 15 ml 塑料管中，膜條按照 樣本編碼進行標記放入 15 ml 塑料管中，然后依次加入 50 μl PCＲ 擴增產(chǎn)物，擰緊蓋子，于 42℃雜交儀中雜 交 60 min，同時將 50 ml 溶液Ⅱ于雜交儀中預熱至 42℃。洗膜: 雜交結(jié)束后取出膜條，轉(zhuǎn)移至預熱 50 ml 溶液Ⅱ的管中，42℃雜交儀中洗滌 10 min。顯色: 新鮮 配置結(jié)合液，膜條裝入結(jié)合液管中，于室溫搖床輕搖 10 min; 取出膜條放入 50 ml 溶液Ⅰ管中室溫輕搖洗 2 次，5 min /次，再用 50 ml 溶液Ⅲ室溫搖洗 2 min。新 鮮配 置 顯 色 液，將膜條浸泡于顯色液中輕搖 5 ～ 10 min，最后將膜條移至純水中終止顯色。將膜條展 開在白紙上，根據(jù)檢測位點的信號觀察結(jié)果。

1． 4 統(tǒng)計學分析

應用 SSPS 24． 0 統(tǒng)計軟件，計數(shù)資 料比較采用 χ2 檢驗，P ＜ 0． 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

462 例患者 進行 25 種 HPV 基因型檢測，其中包括 14 種高危型: HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73; 3 種疑似高危型: HPV26、53、66; 8 種低危型: HPV6、 11、40、42、43、44、81、83。除高危型 HPV45 和低危型 HPV40 無人感染外，其余類型均有感染。462 例患者 HPV 陽性感染率為 19． 5% ( 90 /462% ) ，感染高危型 HPV 的患者 65 例，感染率為 14． 1% ( 65 /462% ) ，占 HPV 陽性的 72． 22% ( 65 /90% ) ，感染低危型 HPV 的 16 例，感 染 率 3． 5% ( 16 /462% ) ，占 HPV 陽 性 的 17． 78% ( 16 /90% ) ; 感染疑似高危型 HPV 的 9 例，感 染 率 1． 9% ( 9 /462% ) ，占 HPV 陽 性 的 10% ( 9 / 90% ) 。單一型感染有 61 例，占 HPV 陽性的 67． 78% ( 61 /90% ) 兩型及以上感染的有 29 例，占 HPV 陽性的 32． 22% ( 29 /90% ) 。90 例 HPV 感染陽性患者檢出不同型別數(shù)合計 122 次，對多重感染者，各型別分別單獨計算。20 ～ ＜ 30 歲、30 ～ ＜ 40 歲、40 ～ ＜ 50 歲和50 ～ ＜ 60 歲4 組 感染 HPV 患者數(shù)比較，40 ～ ＜ 50 歲最多 56 例，30 ～ ＜ 40 歲有 34 例感染，20 ～ ＜ 30 歲有 16 例，50 ～ ＜ 60 歲 有 13 例感染，65 歲和 82 歲分別有 1 例感染 HPV16 型，1 例 72 歲患者感染 HPV31 型。表 2 顯示高危型 HPV16 是感染最多的型別，感染率為 16． 39% ( 20 / 122% ) ，明顯高于其他 HPV 型別。

3 討論

HPV 廣泛存在，人類的 HPV 感染率很高。在自 然人群中，HPV 感染率從低于 1% 到高達 50% ，在性 活躍人群中 20% ～ 80% 的人有 HPV 感染史。HPV 侵入人體后，停留于感染部位的皮膚和黏膜中，并進行 增殖，不進入血液，也不產(chǎn)生病毒血癥。20 世紀 70 年代德國人哈拉爾德·楚爾·豪森提出 HPV 與宮頸 癌有關系，1995 年國際癌癥學會確定: HPV 是宮頸癌 的主要病因。2008 年 10 月 6 號哈拉爾德·楚爾·豪 森因發(fā)現(xiàn) HPV 獲得諾貝爾獎。此后經(jīng)過科學家及醫(yī) 學專家多年的研究證明，高危型 HPV( 人乳頭瘤病毒) 持續(xù)感染是誘發(fā)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的的比較明確的病因。



 

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