血管內(nèi)皮活性物質(zhì)變化動(dòng)態(tài)研究(QL-861使用)

氣血理論是中醫(yī)基礎(chǔ)理論之一，由于氣虛原因出 現(xiàn)血不循經(jīng)、溢出脈外的情況被稱為氣不攝血證。氣 不攝血證常見于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中免疫性血小板減少癥 （immune thrombocytopenia，ITP）、再生障礙性貧 血、膿毒癥、上消化道出血等疾病，尤以 ITP 氣不攝血證研究較多。現(xiàn)代研究顯示，ITP 是由自身 免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的血小板計(jì)數(shù)暫時(shí)或持續(xù)減少的臨床 常見的出血性疾病之一。以往對(duì) ITP 的研究多集中在 免疫系統(tǒng)方面，然而臨床上部分 ITP 患者出現(xiàn)血小板 計(jì)數(shù)重度減少，并未出現(xiàn)明顯出血癥狀，出現(xiàn)上述 情況可能是由于血管內(nèi)皮損傷的程度不一。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

健康 SPF 級(jí) Balb/C 小鼠，雌雄各半，8 周齡，體質(zhì)量 18～22 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公 司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK（京）2016-0006，動(dòng)物 質(zhì)量合格證號(hào) 11400700313965、11400700319519、 11400700311207、11400700311181；健康普通級(jí)豚鼠， 雌性，8 周齡，體質(zhì)量 200 g，北京芳元緣養(yǎng)殖場(chǎng)，動(dòng) 物生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK（京）2014-0012，動(dòng)物質(zhì)量合 格證號(hào) 11804900011954；健康 SPF 級(jí) Balb/C 小鼠， 雄性，8 周齡，體質(zhì)量 18～22 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK（京） 2016-0006，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào) 11400700335844。飼 養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 SPF 級(jí) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，溫度 20～26℃，相對(duì)濕度 40%～70%， 晝夜 12 h 交替，自由攝食飲水。飼料由北京科澳協(xié)力 飼料有限公司提供，飲用水為滅菌水，每日更換。

1.2 試劑

ACD 抗凝劑（A），北京百奧萊博科技有限公司， 批號(hào) 0511A18；水合氯醛，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公 司，批號(hào) T20080902；弗氏完全佐劑（FCA），美國(guó) Sigma 公司，批號(hào) SLBP0432V；弗氏不完全佐劑 （FICA），美國(guó) Sigma 公司，批號(hào) SLBS4985；PBS， 北京索萊寶科技有限公司，批號(hào) 20180419；小鼠 vWF ELISA 檢測(cè)試劑盒，北京安迪華泰科技有限公司，批 號(hào) HT20378；小鼠 NO ELISA 檢測(cè)試劑盒，Andygene 公司，批號(hào) HT20367；小鼠 ET-1 ELISA 檢測(cè)試劑盒， 北京安迪華泰科技有限公司，批號(hào) HT20379；小鼠 AimPlex 流式高通量多因子 VEGF-A、sICAM-1、 sVCAM-1 檢測(cè)試劑盒，北京曠博生物技術(shù)有限公司， 批號(hào) 18101608。

1.3 儀器

全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（NIHOH KOHDEN 公司， MEK-6318K），電子天平（長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公 司，ES-1100；北京賽多利斯儀器有限公司，TP-213）， 流式細(xì)胞分析儀（BD 公司，Calibur），高速冷凍離心 機(jī)（賽默飛世爾科技公司，CL31R），大小鼠抓力測(cè) 定儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司，YLS-13A），酶 標(biāo)儀（Labsystems Multiskan MS，352），醫(yī)用離心機(jī) （北京白洋醫(yī)療器械有限公司，BY-160A），渦旋器 （其林貝爾儀器制造有限公司，其林貝爾QL-861）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 豚鼠抗血小板血清制備

①制備抗原：取 Balb/C 小鼠，雌雄各半，3.5% 水合氯醛腹腔注射麻醉，摘出眼球取血，ACD（A） 抗凝，200×g 離心 10 min。取上層富含血小板血漿， 1700×g 離心 10 min，去上清液，0.1 mol/L、pH 7.4 PBS 沖洗血小板 3 次，調(diào)整血小板數(shù) 2×109 /L。②免疫：將 血小板分別與等量 FCA 和 FICA 混合，成油包水狀， 為 FCA 抗原和 FICA 抗原。取 FCA 抗原，于 0 周注射 豚鼠足掌、背及皮下，共 5 點(diǎn)，每點(diǎn) 200 μL，共 1000 μL。 取 FICA 抗原分別于 1、2、4 周在上述相同部位注射。 第 5 周豚鼠腹主動(dòng)脈取不抗凝全血，室溫放置 1 h， 3500 r/min 離心 10 min，取上清液，置于-30 ℃冰箱 儲(chǔ)存。③紅細(xì)胞吸附：將 APS 從-30 ℃冰箱中取出， 置于 56 ℃水浴中 30 min 滅活補(bǔ)體。將等體積 5%Balb/C 小鼠紅細(xì)胞懸液加到 APS 中，37 ℃孵育 1 h，3500 r/min 離心 10 min，取上清液，上清液再按 上述方法吸附 2 次，即稀釋成 1∶4 濃度，備用。

2.2 造模

在前期研究基礎(chǔ)上，采用睡眠剝奪復(fù)合免疫方 法進(jìn)行造模。睡眠剝奪：將小鼠置于自制水平臺(tái) （水平臺(tái)規(guī)格：平臺(tái)高 40 mm、底盤直徑 60 mm、中 間豎管直徑 10 mm、頂盤直徑 25 mm）上，每籠 4 個(gè) 水平臺(tái)，放置 3 只小鼠。使用鐵絲網(wǎng)將睡眠剝奪籠蓋 住并固定，保證小鼠無法逃脫，但可以移動(dòng)。食物與 飲用水瓶置于鐵絲網(wǎng)食槽內(nèi)，使小鼠可自由攝食飲 水，若小鼠進(jìn)入睡眠狀態(tài)，會(huì)因肌肉松弛而落入水中， 從而使小鼠始終保持清醒狀態(tài)。采取隨機(jī)時(shí)間段剝奪 方法，平均每日剝奪 19 h。每日剝奪結(jié)束后，將小鼠 取出，放回鼠籠。免疫：按 100 μL/20 g 腹腔注射 APS， 隔日 1 次，共注射 7 次。造模：第 1 周進(jìn)行睡眠剝奪， 第 2、3 周睡眠剝奪復(fù)合注射 APS 免疫。

2.3 分組

將雄性 Balb/C 小鼠分為正常組和模型組，各組再分為 7、10、21 d 共 3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，正常組每個(gè)時(shí)間 點(diǎn)各 10 只，模型組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各 12 只。模型組睡眠 剝奪 7 d 后，在睡眠剝奪同時(shí)，每隔 1 d 注射 APS； 正常組每隔 1 d 注射生理鹽水。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)結(jié)束后， 小鼠摘眼球取血，常規(guī)制備血清，-80 ℃冰箱貯藏備 用，進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)

2.4.1 小鼠體征

觀察小鼠精神狀態(tài)、毛色、大便、出血情況等。

2.4.2 體質(zhì)量

測(cè)量小鼠體質(zhì)量。

2.4.3 抓力

使用大小鼠抓力測(cè)定儀測(cè)定小鼠抓力。

2.4.4 血小板計(jì)數(shù)

取小鼠尾靜脈血，使用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)量 血小板數(shù)量。

2.4.5 臟器指數(shù)

小鼠麻醉，取脾臟、胸腺，生理鹽水沖洗后稱重。 計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)（%）＝臟器濕重（g）÷ 小鼠體質(zhì)量（g）×100%。

2.4.6 ELISA 檢測(cè)

血清血管性血友病因子、一氧化氮 和內(nèi)皮素-1 含量 -80 ℃冰箱取出小鼠血清，按 ELISA 試劑盒說明 書進(jìn)行操作，檢測(cè)小鼠血清 vWF、NO、ET-1 含量。

2.4.7 流式法檢測(cè)

血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A、可溶性 細(xì)胞間黏附分子-1、可溶性血管細(xì)胞黏附分子-1 含量 -80 ℃冰箱取出小鼠血清，按 AimPlex 流式高通 量多因子檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)小鼠血清 VEGF-A、sICAM-1、sVCAM-1 含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 — x±s 表示，組間比較用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

正常組小鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)敏捷，活動(dòng)性良 好，毛色純白有光澤，大便呈黃褐色，條狀，顆粒清 晰。第 7 日模型組小鼠精神狀態(tài)萎靡，反應(yīng)遲鈍，每 日停止睡眠剝奪后，倦怠蜷縮，極少活動(dòng)，毛色黯黃 粗糙，大便呈黑褐色或黃色，便稀，隨時(shí)間延長(zhǎng)日益 加重。第 10 日（注射 APS 后 3 d），小鼠腹部、腿部 出現(xiàn)出血點(diǎn)，便血情況出現(xiàn)，第 2 次注射后， 小鼠出血最為嚴(yán)重，此后逐日減輕，第 21 日已無出 血情況。

5 討論

氣是構(gòu)成人體和維持人體生命活動(dòng)的精微物質(zhì)， 血為脈管中流動(dòng)的紅色液體，二者相互作用，保證人 體機(jī)能的正常運(yùn)行。在中醫(yī)理論中，血證有廣義與狹 義之分，其中廣義的血證是指與血液有關(guān)的疾病，狹 義的血證是指由于各種原因?qū)е碌难谎?jīng)，溢出脈 外。氣不攝血是血證的常見病機(jī)，其辨證要點(diǎn)為出血 和氣虛。由于氣的統(tǒng)攝作用，血液才可循行脈中，若 氣虛無法統(tǒng)攝，血溢脈外，則會(huì)出現(xiàn)各類出血。




 

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