人支氣管上皮細胞MRP1的影響分析

多 藥 耐 藥 相 關 蛋 白（Multidrug resistanceassociated protein 1，MRP1）是一種依賴于 ATP 介導 的底物跨膜轉運蛋白，在正常人支氣管上皮細胞基 底 外 側 高 表 達 ， 而 在 慢 性 阻 塞 性 肺 疾 病（chronic obstructive pulmonary disease， COPD）患 者 中 MRP1 表達明顯降低。MRP1 能夠外排吸入性體外化學異 物、毒物及體內的內源性物質 ，從而在肺組織的 抗氧化應激和解毒方面起重要的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞系

SPF 級 SD 大鼠 30 只，體質 量（220±20 g），雌雄各半，由安徽醫(yī)科大學實驗動物 中心提供，許可證號：SCXK（皖）2017-001，本研究 所涉及的動物實驗部分均符合動物倫理委員會的準 則。16HBE 細胞株購自上海子實生物科技有限公司。

1.2 藥物及試劑

化痰降氣膠囊由白芥子、紫蘇子、 白前、金沸草、當歸、炙麻黃六味中藥組成，每克 含 0.833 g 生藥，臨床成人每日服用量為 6 g，相當 于生藥量的 5 g，安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑 中心提供，批號：20170906；高糖培養(yǎng)基（DMEM）， 美國 HyClone 公司，批號：AD19822332；胎牛血 清，美國 Gibco 公司，批號：42G5760K；5-羧基二 乙 酸 熒 光素（5- CFDA），美國 Sigma 公司，批號：BCBT5849；胰 酶 消 化 液 、 BCA 蛋 白 定 量 試 劑 盒 、 LTD4 受體拮抗劑（MK571）、CCK8 試劑盒，碧云天 生 物 技 術 研 究 所 ， 批 號 分 別 為 ： 102218181107、 060216160922、 033018180918、 091818190220； 光 譜彩虹預染蛋白 Marker，美國 Fermentas 公司，批 號：00690770；MRP1 抗體、Notch1 抗體、Hes1 抗 體 ， 英 國 Abcam 公 司 ， 批 號 分 別 為 ： ab180960、 ab52627、ab108937；甘油醛-3 磷酸脫氫酶（GAPDH） 抗體、辣根酶標記山羊抗兔 lgG、辣根酶標記山羊抗 小鼠 lgG，北京中杉金橋生物技術有限公司，批號分 別為：OTI2D9，ZB-2301，ZB-2305；ECL 超敏發(fā)光 試 劑 盒 ， 美 國 Thermo 公 司 ， 批 號 ： SI257444； DAPT，美國 APE x BIO 公司，批號：208255-80-5。

1.3 儀器

371 型 CO2細胞培養(yǎng)箱、1500 型全波長酶 標儀，美國 Thermo Scientific 公司；超凈工作臺（YJ1405），蘇凈集團安泰公司；倒置相差顯微鏡、熒光 顯微鏡，日本 Olympus 公司；流式細胞儀，美國 Beckman 公司；蛋白電泳及轉膜設備，北京六一生物 科技有限公司；凝膠成像儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.4 含藥血清的制備

SD 大鼠 30 只，適應性飼養(yǎng) 1 周后隨機分為空白組和給藥組。將化痰降氣膠囊中 的粉末用生理鹽水配成 0.07 g·mL-1 的混懸液，給藥 組按照 10 mL·kg- 1 灌胃給藥，每天 2 次，連續(xù) 7 d。 空白組給予等劑量的生理鹽水。末次給藥 1 h 后，腹 腔注射 20%烏來糖麻醉（1 g·kg-1 ），腹主動脈取血， 37 ℃靜置 1 h 后，3 500 r·min-1 ，離心 10 min；將 相同條件下所采血清混和，56 ℃水浴滅活 30 min，以 除去可能存在的生物活性物質；再用 0.22 μm 的微 孔濾膜過濾除菌，密封后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?同時以生理鹽水制備的正常大鼠血清作對照。

1.5 香煙煙霧提取物（CSE）的制備及實驗室前期預實驗

將一根去過濾嘴香煙點燃，煙霧 通過注射器連續(xù)抽吸與 5 mL 的 DMEM 劇烈搖晃混 合，調整 pH 值至 7.2~7.4，經 0.22 μm 微孔濾膜過 濾除菌，此時 CSE 濃度定為 100%，根據(jù)前期預實驗 結果，采用 5% CSE 濃度用于后續(xù)實驗。

1.6 細胞培養(yǎng)、分組及給藥方法

將 16HBE 細胞培 養(yǎng)于 DMEM 培養(yǎng)基（含 10%胎牛血清，100 U · mL-1 青霉素和鏈霉素）中，置于 37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)，每 2 d 換液 1 次，4～5 d 細胞生長密度達到 80%左右以 0.25%胰蛋白酶消化、傳代。將細胞分為 空白血清組（15%正常大鼠血清）、化痰降氣膠囊含藥血清低、中、高劑量組（5%、10%、15%含藥血清）、 CSE 刺激組（5% CSE+15%正常大鼠血清）、CSE+含 藥血清組（5% CSE+15%含藥血清）、DAPT 抑制劑組 （50 μmol · L-1 DAPT+15%空白血清）、DAPT 抑制劑 加中藥組（50 μmol · L-1 DAPT +15%含藥血清）。

2 結果

2.1 化痰降氣膠囊含藥血清對 16HBE 細胞活力的影響

與正常對照組比較，5% ~ 20%濃度的化痰降氣 膠囊含藥血清促進細胞增殖，差異有統(tǒng)計學意義 （P < 0.01）。且濃度為 15%時，16HBE 細胞增殖率最 高。故選用 5%、10%、15%為低、中、高濃度用于 后續(xù)研究。

2.2 各組 16HBE 細胞中 Notch1、Hes1、MRP1 蛋白表達

比較 利用 Western Blot 技術，以 GAPDH 為內 參，計算各組細胞中 Notch1、Hes1、MRP1 蛋白的相 對表達量。與空白血清組比較，各含 藥血清組 Notch1、MRP1、Hes1 蛋白表達均呈濃度依 賴性升高；其中 5%濃度組 Hes1 蛋白表達及 10%、 15%濃度組 Notch1、MRP1、Hes1 蛋白表達均有統(tǒng)計 學意義（P < 0.05，P < 0.01）。15%化痰降氣膠囊含 藥血清上調 Notch1、MRP1、Hes1 蛋白表達的趨勢最 為顯著，故在后續(xù)實驗中均選用此濃度的含藥血 清。與空白血清組比較，CSE 刺激組 的 Notch1、MRP1 、Hes1 蛋白表達顯著降低（P < 0.01）；與 CSE 刺激組比較，化痰降氣膠囊含藥血清 干預可逆轉 CSE 誘導的蛋白表達下調，差異有統(tǒng)計 學意義（P < 0.05，P < 0.01）。與空白 血清組比較，DAPT 抑制劑組 Notch1、MRP1、Hes1 蛋白表達含量均顯著下降（P < 0.05，P < 0.01），15% 含藥血清可顯著提高 Notch1、MRP1、Hes1 蛋白的表 達（P < 0.05，P < 0.01）。與單獨加入 15%含藥血清 組比較，DAPT + 15%含藥血清組的 Notch1、Hes1、 MRP1 蛋白表達含量均下調，差異有統(tǒng)計學意義 （P < 0.05，P < 0.01），說明抑制 Notch 通路，有抑制 含藥血清上調 MRP1 表達的作用。

3 討論

慢性阻塞肺病（COPD）是一種可防治的常見疾 病，其特征為持續(xù)存在的呼吸道癥狀和氣流受限， 通常由有害顆?；驓怏w暴露引起的氣道和（或）肺泡 異常而導致。目前，COPD 的發(fā)病機制尚未完全明 了，主要與肺內氧化應激、蛋白酶和抗蛋白酶失 衡、肺部炎性反應及免疫功能紊亂密切相關，往往 是機體內外多種因素相互作用的結果 。MRP1 作 為兩性有機陰離子轉運載體，在肺組織中發(fā)揮重要 的屏障功能，其對吸入性化學異物或毒物、其特異性底物白三烯 C4（LTC4）、及在肺部氧化應激的病理生 理過程中起重要作用的還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化 型谷胱甘肽（GSSG）都起著外排功能 ，還可以調控 反炎癥信號以控制嗜中性粒細胞的跨上皮遷移從而 減少過度炎癥。



 

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