血清炎癥細(xì)胞因子的影響分析

變應(yīng)性鼻炎（ａｌｌｅｒｇｉｃｒｈｉｎｉｔｉｓ，ＡＲ）是機(jī) 體 接 觸 變應(yīng)原后由免疫球蛋白 Ｅ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＥ，ＩｇＥ） 介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性慢性炎癥性疾病，其典型癥 狀為陣發(fā)性噴嚏、鼻癢和鼻塞、流涕等。ＡＲ 的發(fā) 病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)代研究認(rèn)為其主要是免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞 Ｔｈ１與 Ｔｈ２比例 失 衡 引 起 的 變 應(yīng) 性 炎 癥 疾 病。當(dāng) Ｔｈ１細(xì)胞 釋 放 的 干 擾 素－γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ，ＩＦＮ－γ）等 細(xì)胞因子不足時(shí)，Ｔｈ２細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)亢進(jìn)現(xiàn)象，產(chǎn)生大 量的 白 細(xì) 胞 介 素－４（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４，ＩＬ－４）等 細(xì) 胞 因 子，從而引 起ＩｇＥ 過 量，引 起 ＡＲ。目前 臨 床 治 療 ＡＲ的藥物種類有糖皮質(zhì)激素類、抗組胺類、抗白 三烯類等，其中抗組胺類藥物具有良好的安全性、較 少的不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)而成為臨床常用藥，如氯雷他 定、依巴斯汀。

１ 材料

１．１ 動(dòng)物及分組

ＳＰＦ級(jí)豚鼠７０只，體質(zhì)量２００～ ２４０ｇ，購于南京市江寧區(qū)青龍動(dòng)物繁殖場［生 產(chǎn) 許 可證號(hào)：ＳＣＸＫ（蘇）２０１２－０００８］。將豚鼠隨機(jī)分為正 常組，模型組，氯 雷 他 定 組（２ｍｇ／ｋｇ），玉屏 風(fēng) 散 組 （３ｇ／ｋｇ），蒼耳 子 水 提 取 物 高 劑 量（４ｇ／ｋｇ，相 當(dāng) 于 成人臨床用量的６倍）、中劑量（２ｇ／ｋｇ）、低劑量（１ ｇ／ｋｇ）組，每組１０只，雌雄各半。

１．２ 藥物與試劑

中藥蒼耳子于２０１７年１０月采 自北京市朝陽區(qū)長鄉(xiāng)店，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)方成武 教授鑒定為菊科植物蒼耳 （Ｘａｎｔｈｉｕｍｓｉｂｉｒｉｃｕｍ Ｐａｔｒ．）成熟帶總苞的果實(shí)。采用水提取法制備， 濾液加熱濃縮至濃度為０．４ｇ／ｍＬ，備用；將氯雷他 定片溶于蒸餾水，制成２ｍｇ／ｍＬ 的溶液；將玉屏風(fēng) 散溶于蒸餾水，制成３ｇ／ｍＬ的溶液。 卵蛋白（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ，ＯＶＡ；批 號(hào) ９２６Ａ０３４）：北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鋁（批 號(hào) ２１６４５－５１－ ２）：上海麥克林生化科技有限公司；氯雷他定（批號(hào) １８０２２５０７３）：西安 楊 森 制 藥 有 限 公 司；玉 屏 風(fēng) 顆 粒 （批 號(hào) ＺＦＢ１７０４）：云 南白藥集團(tuán)股份有限公司； ＩｇＥ、ＩＬ－４、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＡ 檢測 試 劑 盒（批 號(hào) 分 別 為 ２０１８０５１６、２０１８０５２２、２０１８００４２６）：北京 安 迪 華 泰 科 技有限公司。

１．３ 儀器

ＭＳＳ全波長酶標(biāo)儀（型號(hào) ＲＴ－６０００）： 深 圳 雷 杜 公 司；高 速 冷 凍 離 心 機(jī) （型 號(hào) ＪＷ３０２１ＨＲ）：安徽嘉文儀器公司；渦旋混合器（型號(hào) ＧＬ－８８Ｂ）：其林貝爾儀器制造公司；ＴＳ－１２生物組織 自動(dòng)脫 水 機(jī)；ＢＭ－ＩＸ 生物 組 織 石 蠟 包 埋 機(jī)；ＬＥＩＣＡ ２０１６ 輪 轉(zhuǎn) 式 切 片 機(jī)；ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５１ 顯 微 鏡；ＪＤ－ ８０ＩＤ形態(tài)學(xué)圖形分析系統(tǒng)。

２ 方法

２．１ 模型復(fù)制

基礎(chǔ)致敏階段采用腹腔注射、局部 刺激 階 段 采 用 滴 鼻 的 方 法 復(fù) 制 ＡＲ 豚鼠 模 型。 ①基礎(chǔ)致敏階段：ＯＶＡ 和氫氧化鋁以１∶１００容積比 溶于生理鹽水中，使 ＯＶＡ 的濃度為０．３％，作為致 敏劑。每只豚鼠腹腔注射１ｍＬ，隔日１次，共致敏 ７次，用時(shí)１４ｄ。②局部刺激階段：從第２２—３１天， 對(duì)每只豚鼠采用滴鼻法，以５％ ＯＶＡ 生理鹽水溶液 每側(cè)５μＬ滴于豚鼠雙側(cè)鼻孔，隔日１次。以上步驟 正常組均以等容積生理鹽水代替。 每日滴鼻后，依據(jù)鼻癢、流涕、呼吸輕重 程 度 及 噴嚏次 數(shù) 多 少 為 評(píng) 分 標(biāo) 準(zhǔn)。① 鼻 癢：輕 擦 鼻 幾 次，計(jì)１分；撓 鼻 不 止，計(jì)２分；不 斷 撓 鼻，計(jì)３分。 ②流涕：流至前孔，計(jì)１分；過鼻孔，計(jì)２分；流涕滿 面，計(jì)３分。③呼吸：呼吸急促，計(jì)１分；明顯喘息， 計(jì)２分；喘息致死，計(jì)３分。④噴嚏：滴鼻后３０ｍｉｎ 內(nèi)１～３個(gè)，計(jì)１分；４～１０個(gè)，計(jì)２分；１０個(gè)以上，計(jì) ３分。于第２２、２６、３０天滴 鼻 后３０ ｍｉｎ內(nèi)，觀察 各 組豚鼠的過敏性癥狀，并將各癥狀積分疊加，總分大 于５分者為模型復(fù)制成功。

２．２ 分組及給藥

最后一次滴鼻后，根據(jù)鼻部行為 學(xué)癥狀評(píng)分結(jié)果重新隨機(jī)分為７組。正常組與模型 組豚鼠灌胃給予等容量蒸餾水，其余各組豚鼠分別 灌胃給予相應(yīng)藥物，連續(xù)１４ｄ，每日１次。同時(shí)采用 ５％ ＯＶＡ 生理鹽水溶液隔日滴鼻，以維持過敏性癥 狀直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。并于給藥后第７、１３天滴鼻后３０ ｍｉｎ觀察過敏性癥狀并進(jìn)行評(píng)分。

２．３ 檢測指標(biāo)及方法

２．３．１ 鼻部行為學(xué)癥狀觀察

模型復(fù)制期間，于局 部刺激階段觀察第２２、２６、３０天各組豚鼠的過敏性 癥狀并進(jìn)行評(píng)分。給藥期間，于給藥第７、１３天再次激發(fā)，觀察各組豚鼠的過敏性癥狀并記錄最后一次 滴鼻評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見“２．１項(xiàng)”。

２．３．２ 鼻黏 膜 組 織 病 理 變 化 觀 察

末 次 給 藥１ｈ 后，用１０％水合氯醛麻醉處死豚鼠，打開鼻蓋骨，暴 露鼻甲及骨性 鼻 中 隔，剝 離 完 整 鼻 黏 膜 后 放 入４％ 甲醛固定，蘇木精－伊紅（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎ，ＨＥ）染 色，光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照、分析。

２．３．３ 血清ＩＬ－４、ＩＦＮ－γ及ＩｇＥ水平檢測

末次給 藥１ｈ后，用１０％水合氯醛麻醉處死。腹主動(dòng)脈取 血，推入離心管靜置３ｈ后，４ ℃ ３０００ｒ／ｍｉｎ離心 １０ｍｉｎ，收集血清。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒 說明書 操 作，依 次 檢 測 實(shí) 驗(yàn) 豚 鼠 血 清 中ＩＬ－４、ＩＦＮ－ γ、ＩｇＥ水平。 ２．４ 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 ＳＰＳＳ１７．０軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 學(xué)分析。連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ｘ珚±ｓ）”進(jìn) 行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。采用單因素方差分析（數(shù)據(jù)全呈正 態(tài)分布時(shí)）或 Ｋｒｕｓｋａｌ－ＷａｌｌｉｓＨ 檢驗(yàn)（數(shù) 據(jù) 不 全 呈 正態(tài)分布時(shí)）比較各組數(shù)據(jù)。Ｐ＜０．０５為差異有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。

３ 結(jié)果

模 型 復(fù) 制 期 間，從 第１次 滴 鼻 開 始，豚 鼠 ３０ｍｉｎ內(nèi)均出 現(xiàn) 不 同 程 度 撓 鼻、噴 嚏 癥 狀，但 無 明 顯流涕、呼吸急促等癥狀；從第３次滴鼻開始，復(fù)制 模型的豚鼠不僅出現(xiàn)撓鼻不止、噴嚏不斷，還出現(xiàn)流 涕、呼吸急促等癥狀；隨著滴鼻次數(shù)的增加，模型豚 鼠過敏性癥狀也越來越明顯。結(jié)果說明采用 ＯＶＡ 和氫氧化鋁腹腔注射并局部刺激的豚鼠 ＡＲ模型復(fù) 制成功。給藥后，與模型組相比，除玉屏風(fēng)散組 外，其 他 用藥組 ＡＲ豚鼠鼻部行為學(xué)癥狀積分均有不同程度 的降低，但差 異 無 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（Ｐ＞０．０５）。結(jié)果 說 明蒼耳子水提取物對(duì) ＡＲ豚鼠的過敏性癥狀有一定 影響。

４ 討論

蒼耳子作為臨床治療鼻淵頭痛的常用藥，具有 抗炎、鎮(zhèn)痛、抗過敏、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用。在 調(diào)節(jié)免疫功能方面，蒼耳子水煎液中琥珀酸被認(rèn)為 可能是蒼耳子調(diào)節(jié)免疫功能的活性成分之一。 王龍妹等發(fā)現(xiàn)，蒼耳子水煎液對(duì)細(xì)胞免疫作用明 顯。張芩等發(fā)現(xiàn)，玉屏風(fēng)散合蒼耳子散可調(diào)節(jié)機(jī) 體免疫功能。



 

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