淺談分子流行病學(xué)研究

新德里金屬 β-內(nèi)酰胺酶( New Delhi metallo-betalactamase，NDM) 是一種新型的碳青霉烯酶，于 2009 年 首次從印度新德里一所醫(yī)院住院患者體內(nèi)的肺炎克雷 伯菌和大腸埃希菌中分離得到。自從 2010 年產(chǎn)NDM 的肺炎克雷伯菌在我國浙江地區(qū)被首次報(bào)道以來，現(xiàn)已在全國多個(gè)地區(qū)的不同菌種中均有不同程 度的流行。

1 材料與方法

1． 1 菌株來源

收集 2017 年 6 月—2018 年 2 月浙江 大學(xué)麗水醫(yī)院臨床分離的碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的 大腸埃希菌，通過藥敏檢測及 PCＲ 驗(yàn)證分離出共 9 株 產(chǎn) NDM 的大腸埃希菌( 已刪除重復(fù)菌株) 。分別來源 于新生兒科( 3 株) 、婦科( 2 株) 、重癥醫(yī)學(xué)科( 1 株) 、 急診( 1 株) 、血液內(nèi)科( 1 株) 和腎內(nèi)科( 1 株) 。其中 有 4 株分離自尿液，3 株分離自全血，2 株分離自痰液。

1． 2 儀器和試劑

藥敏 M-H 培養(yǎng)基和藥敏紙片均購 自英國 Oxoid 公司，包括美羅培南、亞胺培南、厄他培 南、氨芐西林、頭孢他啶、頭孢曲松、氨曲南、慶大霉素、 妥布霉素、左氧氟沙星、阿米卡星、米諾環(huán)素、多黏菌素 B 等。Vitek-2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀購自法國 梅里埃公司。采用的 PCＲ 擴(kuò)增儀為 PTC-200 Peltier Thermal Cycle，電泳儀、電泳槽購自上海天能科技有限 公司，ZF-1紫外分析儀購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司，DNA marker 購自全式金生物技術(shù)有限公司，引物及測序由生工生 物工程( 上海) 有限公司完成。

1． 3 藥敏試驗(yàn)

采用 Vitek-2 Compact 全自動(dòng)微生物 鑒定儀聯(lián)合紙片擴(kuò)散法( K-B 法) 進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏 結(jié)果按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)( CLSI) 2017 年的標(biāo)準(zhǔn)判定。

1． 4 耐藥基因檢測和序列分析

熱裂解法提取菌株 DNA。采用 PCＲ 技術(shù)篩選可能攜帶的耐藥基因。本 研究 中 納 入 的 耐 藥 基 因 包 括: β-內(nèi) 酰 胺 酶 基 因 ( blaNDM、blaSHV、blaTEM、blaCTX-M) ; 喹諾酮類耐藥基因和碳青霉烯類耐藥基因( OXA-48、KPC) ; PCＲ 擴(kuò)增 后將產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司進(jìn)行雙向測序， 測序結(jié)果經(jīng) BLAST ( http: / /blast． ncbi． nlm． nih． gov / blast． cgi) 確定耐藥基因分型。

1． 5 質(zhì)粒復(fù)制子分型

堿裂解法提取細(xì)菌質(zhì)粒，采用 PCＲ 技術(shù)對(duì)所有菌株進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制子類型的篩選分析。

1． 6 腸桿菌基因間重復(fù)共有序列聚合酶鏈反應(yīng) ( EＲIC-PCＲ) 分型

熱裂解法提取細(xì)菌 DNA，采用存在于腸桿菌科細(xì)菌 DNA 中的重復(fù)序列為引物，EＲIC1: 5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’，EＲIC2: 5’- AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’進(jìn)行 PCＲ 反應(yīng)擴(kuò) 增，然后將產(chǎn)物于 1% 瓊脂糖凝膠中，120 V 電泳 20 min 后用凝膠成像儀觀察電泳條帶的分布并對(duì)其進(jìn)行 分型。

1． 7 多位點(diǎn)序列分型( MLST)

采用 PCＲ 法對(duì)大腸 埃希菌的 7 個(gè)管家基因( adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA) 進(jìn)行擴(kuò)增并測序，引物序列參考網(wǎng)站 https: / / mlst． warwick． ac． uk /mlst /dbs/Ecoli。并將所得的測序 結(jié) 果 于 https: / /pubmlst． org /bigsdb? db = pubmlst _ mlst_seqdef 網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，得出菌株的序列分型。

1． 8 質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)

以這 9 株產(chǎn) NDM 的大腸埃 希菌為供體菌，以耐疊氮鈉的大腸埃希菌 J53 為受體 菌。供體菌和受體菌分別接種于 4 mL LB 肉湯培養(yǎng)基 中，35 ℃，200 r/min 培養(yǎng) 4 h，然后各吸取 100 μL 到 4 mL新鮮的 LB 中，混合后于 35 ℃ 培養(yǎng)箱靜止孵育 16 ～ 18 h，后取 0． 1 mL 混合菌液涂布于含氨芐西林 ( 100 mg /L) 和疊氮鈉( 100 mg /L) 的瓊脂平皿上，培養(yǎng) 箱孵育 16 ～ 18 h，挑取在平皿上生長的疑為轉(zhuǎn)移接合 子的菌落接種至氨芐平皿，后續(xù)進(jìn)行菌種鑒定、藥敏試 驗(yàn)、PCＲ 檢測耐藥基因以確定為轉(zhuǎn)移接合子。

2 結(jié) 果

來源及臨床特征 9 株產(chǎn) NDM 的 大腸埃希菌中有 4 株分離自尿液( 44． 5% ) ，3 株分離 自全血( 33． 3% ) ，2 株分離自痰液( 22． 2% ) 。其中有 3 株來自新生兒科，2 株來自門急診，血液內(nèi)科、腎內(nèi) 科、婦科和重癥醫(yī)學(xué)科各 1 株?；颊咝詣e、年齡及臨床 診斷等相關(guān)信息見表 1。

9 株產(chǎn) NDM 的大腸埃希菌呈現(xiàn) 多重耐藥性，其中對(duì) β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類耐藥率最 高，在這類藥物中除了對(duì)氨曲南的耐藥率較低為 33． 3% 外，其余耐藥率為 100． 00% 。對(duì)碳青霉烯類抗 菌藥物美羅培南、亞胺培南和磺胺類抗菌藥物復(fù)方新 諾明的耐藥率均為 100． 00% 。對(duì)氨基糖苷類抗菌藥 物妥布霉素、慶大霉素、阿米卡星等耐藥率較低，分別 為22． 2% 、33． 3% 、0． 0% 。對(duì)四環(huán)素類抗菌藥物米諾環(huán)素耐藥率為 22． 2% 。

3 討 論

自新德里金屬 β-內(nèi)酰胺酶-1 型( New Delhimetallo-β-lactamase 1，NDM-1 ) 于 2009 年在印度首次報(bào) 道以來，攜帶該基因的細(xì)菌已被發(fā)現(xiàn)在全球范圍內(nèi) 流行并引發(fā)多種類型感染。目前已發(fā)現(xiàn)的 NDM 亞型有 17 種，分 別 為 NDM-1 ～ NDM-17 型，其 中 以 NDM-1 亞型最為多見。攜帶 blaNDM-1 基因的菌株往 往同時(shí)攜帶有編碼其他抗菌藥物相關(guān)的耐藥基因，如 β 內(nèi)酰胺酶類、喹諾酮類和氨基糖苷類等，導(dǎo)致只有 少數(shù)抗菌藥物如多黏菌素、替加環(huán)素等對(duì)此類細(xì)菌具 有一定的抗菌作用，該類病原菌也因此被稱為“超級(jí)細(xì) 菌”。而在本研究中 9 株產(chǎn) NDM 的大腸埃希菌均 為 NDM-5 型。NDM-5 與 NDM-1 只有 2 個(gè)氨基酸的差 別，262 位氨基酸由 G 變?yōu)?T 和 460 位 A 變?yōu)?C。 相較于 NDM-1，NDM-5 對(duì)碳青霉烯類和廣譜 β 內(nèi)酰胺 類抗菌藥物具有更高的耐藥水平。