分析無(wú)菌檢查及適用性研究

注射劑無(wú)菌檢查是藥品質(zhì)量控制的一個(gè)重要環(huán) 節(jié)，微生物的生長(zhǎng)受許多因素的影響，為保證藥品安 全、有效，并與國(guó)際接軌，提高我國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，從《中 華人民共和國(guó)藥典》2005 年版起均要求對(duì)藥品進(jìn)行 無(wú)菌檢查，并規(guī)定了驗(yàn)證的方法、菌株及判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與儀器

1．1 材料

復(fù)方甘草酸苷注射液，蘭州大得利生物化學(xué)制 藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 H20090231，每支20 mL，批號(hào) 20170201，20170202; 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基( 批號(hào)20170311) 、 胰 酪 大 豆 胨 液 體 培 養(yǎng) 基 ( 批 號(hào) 20170830) 、胰 酪 大 豆 胨 瓊 脂 培 養(yǎng) 基 ( 批 號(hào) 20170425) 、沙 氏 葡 萄 糖 瓊 脂 培 養(yǎng) 基 ( 批 號(hào) 20170421) 、沙 氏 葡 萄 糖 液 體 培 養(yǎng) 基 ( 批 號(hào) 20170412) 、pH 7． 0 氯化鈉 － 蛋白胨緩沖液( 批號(hào) 20170411) ，均購(gòu)自北京三藥科技開發(fā)公司，培養(yǎng)基 靈敏度及無(wú)菌檢查均符合《中華人民共和國(guó)藥典》 2015 年版規(guī)定。大腸埃希菌、枯 草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌 、生孢梭菌、 白色念珠菌和黑曲霉，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1．2 儀器

LA2－4A1 生物安全柜( 新加坡藝思高科技有限 公司) ，MJ － 250 生化培養(yǎng)箱( 上海一恒醫(yī)療機(jī)械 廠) ，GL-1700干式恒溫器( 海門市其林貝爾儀器制造有限公司) 。

2 方法與結(jié)果

1) 分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯 草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 中，于 30～35 ℃條件下培養(yǎng) 18 ～ 24 h，用 pH 7．0 氯 化鈉－蛋白胨緩沖液稀釋制成菌懸液，取適宜稀釋 級(jí)菌懸液 1 mL，置于直徑為 90 mm 的無(wú)菌平皿中， 注入 20 mL 溫度不超過(guò) 45 ℃ 的胰酪大豆胨瓊脂培 養(yǎng)基中，每個(gè)菌液濃度注 2 個(gè)平皿，混勻，凝固，倒置 培養(yǎng)，測(cè)定菌懸液中菌落的數(shù)量。
2) 接種生孢梭菌 的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，于 30 ～ 35 ℃條件下培養(yǎng) 18 ～ 24 h，用 pH 7．0 氯化鈉－蛋白 胨緩沖液稀釋制成菌懸液，取適宜稀釋級(jí)菌懸液 1 mL，置于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)。
3) 接 種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng) 基中，于20～25 ℃條件下培養(yǎng) 24 ～ 48 h，用 0．9%無(wú) 菌氯化鈉溶液稀釋制成菌懸液。
4) 接種黑曲霉的 新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 5 ～ 7 d，加入 3 ～ 5 mL 0．9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗 脫，吸出孢子懸液( 用管口帶有薄的無(wú)菌棉花或紗 布的能通過(guò)濾菌絲的無(wú)菌毛細(xì)吸管) 至無(wú)菌試管 內(nèi)，用 0．9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋制成孢子懸液，取 適宜稀釋級(jí)菌懸液 1 mL，置于直徑為 90 mm 的無(wú)菌 平皿中，每個(gè)菌液濃度注 2 個(gè)平皿，注入 20 mL 溫度 不超過(guò) 45 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，凝 固，倒置培養(yǎng)，測(cè)定菌懸液中菌落的數(shù)量。取裝有濾膜孔徑為 0．45 μm 的 二聯(lián)封閉薄膜過(guò)濾器 3 組( 共 6 個(gè)濾筒) ，分別加入 與試驗(yàn)組過(guò)濾筒內(nèi)相同且等量的培養(yǎng)基和小于 100 cfu的試驗(yàn)菌，作為菌液對(duì)照組。

3 討論

復(fù)方甘草酸苷注射液為復(fù)方制劑，其組分為甘 草酸苷、鹽酸半胱氨酸和甘氨酸。由本研究預(yù)試 驗(yàn)結(jié)果可知，采用常規(guī)方法直接過(guò)濾樣品，對(duì)大腸埃 希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲 霉均無(wú)抑制作用; 加入金黃色葡萄球菌 72 h 內(nèi)結(jié)果為陰性，說(shuō)明復(fù)方甘草酸苷注射液中含有抑菌成分。經(jīng)進(jìn)一步試驗(yàn)，每膜采用 pH 7．0 的0．1%無(wú) 菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液 200 mL 沖洗，完全消除了 樣品對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用，所以確定復(fù)方 甘草酸苷注射液無(wú)菌檢查方法為: 取復(fù)方甘草酸苷 注射液 10 支，先用 pH 7．0 的 0．1%無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液浸潤(rùn) 2 筒過(guò)濾器濾膜，過(guò)濾樣品，每膜經(jīng) pH 7．0 的 0．1%無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液200 mL 沖洗，最后加入 100 mL 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰 酪大豆胨液體培養(yǎng)基，以金黃色葡萄球菌作為陽(yáng)性 對(duì)照菌進(jìn)行無(wú)菌檢查，方法可行。