用其林貝爾QL-901對生物活性限值檢測

1 材料 

1.1 細(xì)胞 

大鼠心肌細(xì)胞株 H9c2（購買于中國醫(yī)學(xué)科學(xué) 院協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心）。 

1.2 藥品與試劑

 附子樣品共 4 批，購自四川江油中壩附子科技 發(fā)展有限公司，產(chǎn)地分別為云南（批號：HSPYN）、 陜西漢中（批號：HSPSXHZ）、四川江油（批號：HS PSCJY 和 HSPSCJY1）。 新烏頭堿（中國食品藥品檢定研究院，批號： 110799-201608）；DMEM 培養(yǎng)基（美國 HyClone 公 司，批號：AE25719272）；胎牛血清（美國 Gibco 公 司，批號 A10112-2770）；0.25 % 胰 蛋白酶（美國 HyClone 公司，批號：MHE86395）；青、鏈霉素（美 國 Hyclone 公 司，批 號：AB10190291，J170012）； CCK-8（碧云天生物 技 術(shù)有限責(zé)任公司，批號： 112018190218）；PBS（北京益美源生物科技有限責(zé)任公司，11310210）。 

1.3 儀器 

MCO-15A 型 CO2 培養(yǎng)箱（日本三洋電機(jī)國際 貿(mào)易有限公司）；YUETAN 型超凈工作臺（北京半 導(dǎo)體設(shè)備一廠）；DT5-6A 型臺式離心機(jī)（北京時代 北利離心機(jī)有限公司）；Axioobserver 倒置顯微鏡 （德國 ZEISS 公司）；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（美國 Thermo 公司）；ME104E 型電子分析天平（瑞士梅 特勒 - 托利多公司）；其林貝爾QL-901 型渦旋儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板及培 養(yǎng)瓶（美國 Corning 公司）

2 方法

附子水提物由中國中藥有限公司制備，制備方 法如下：分別稱取黑順片 200 g，浸泡 30 min，煎煮 2 次，第 1 次加 9 倍量水，煎煮 30 min，第 2 次加 7 倍量水，煎煮 25 min，200 目篩過濾，65℃減壓濃 縮，測定濃縮液密度及干膏得率，冷凍干燥制備成 凍干粉備用。4 個批次（批號：HSPYN、HSPSXHZ、 HSPSCJY、HSPSCJY1）的附子水提物的干膏得率 分別為 21.42%、9.85%、8.79% 和 15.26%。附子水提物：精密稱取各批號附子水提物凍 干粉，加入 DMEM 完全培養(yǎng)基溶解。使用 0.22μm 濾膜過濾雜質(zhì)，配制為 0.25 mg·mL-1 附子水提物 母液，再用 DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)工作濃 度，現(xiàn)用現(xiàn)配。新烏頭堿：精密稱取新烏頭堿粉末， 加入去離子水溶解，使用 0.22μm 濾膜過濾雜質(zhì)， 配制為 18 mg·mL-1 母液。凍存于 -20℃，使用時加 入 DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)工作濃度，現(xiàn)用 現(xiàn)配。H9c2 細(xì)胞培養(yǎng)于 DMEM 培養(yǎng)基（含 10 % 胎 牛血清，100 U·mL-1 青、鏈霉素，4 mM L- 谷氨酰 胺）中，置于 37℃，5%CO2 及飽和濕度的培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)。加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶按照 1：3 比例傳 代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

3 結(jié)果

結(jié)果顯示，各密度下 H9c2 細(xì)胞在 0 ～ 48 h 為 增殖期，48 ～ 60 h 到達(dá)平臺期，60 ～72 h 進(jìn)入衰 亡期。當(dāng)細(xì)胞密度為 2×105 /mL 時，細(xì)胞生長過快， 不利于下一步實驗。故選用 0.5×10/mL 或 1×105 /mL 密度進(jìn)行下一步實驗。預(yù)實驗結(jié)果顯示附子水提物最大溶解濃度為 250 μg·mL-1，因而選擇最大給藥濃度 125 μg·mL-1 作為藥物測試濃度；新烏頭堿作為陽性對照藥，濃 度選擇為 100 μg·mL-1。結(jié)果顯 示，當(dāng)細(xì)胞密度 為 0.5×105 /mL，作用時間為 12 h 時，附子水提物和 新烏頭堿對細(xì)胞增殖抑制作用較強，且作用穩(wěn)定， RSD<15%。故選用 0.5×105 /mL，藥物作用 12 h 進(jìn) 行后續(xù)實驗。

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