蠟樣芽孢桿菌分析（其林貝爾QL-866使用）

1 引 言

蠟樣芽孢桿菌作為一種常見的食源性致病微生物, 廣泛存在于水、空氣、土壤等可能與食品接觸的環(huán)境中, 較 容易引起食物中毒。蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)屬于兼 性喜氧菌, 革蘭氏陽性桿菌。在 20~45 ℃生長(zhǎng)較好, 而在 10 ℃或 10 ℃以下生長(zhǎng)緩慢或不生長(zhǎng), 而在 100 ℃加熱一 定時(shí)間即可殺死該菌。由于毒性因子及生長(zhǎng)環(huán)境的不同, 一些蠟樣芽孢桿菌在食品行業(yè)和畜牧上會(huì)被作為益生菌添 加到食品和飼料中,有的菌株則為條件性致病菌,對(duì)食品 健康以及人們生存環(huán)境造成影響巨大。蠟樣芽孢桿菌分布 較廣,在生熟制品食品中較常見,容易造成食物中毒。而食 物放置時(shí)間較長(zhǎng)或保存溫度不當(dāng), 容易使污染的蠟樣芽孢 桿菌繁殖, 從而產(chǎn)生毒素引起中毒。在美國(guó), 引發(fā)蠟樣芽 孢桿菌食物中毒的主要原因是炒米飯; 在歐洲主要由牛 奶、肉類食品和甜品引起,在我國(guó)主要與受污染的米飯或淀 粉類制品有關(guān)。嘔吐和腹瀉是蠟樣芽孢桿菌的中毒典型 癥狀,與其他細(xì)菌毒素導(dǎo)致的中毒癥狀較相似, 如金黃色 葡萄球菌腸毒素, 二者都能導(dǎo)致急性的惡心與嘔吐癥狀, 因此, 容易低估蠟樣芽孢桿菌所導(dǎo)致的食物中毒事件。

2 材料與方法

2.1 試劑、儀器與材料

蠟樣芽孢桿菌 (CMCC63303) 、金黃色葡萄球菌 (ATCC6538)、鼠傷寒沙門氏菌(CMCC 50115)、單增李斯特 菌(ATCC 19115)、枯草芽孢桿菌(ATCC6633)、蘇云金芽孢 桿菌、大腸埃希氏菌 (CMCC44102) 、販崎腸桿菌 (ATCC29544)(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。 兔抗蠟樣芽孢桿菌抗體(實(shí)驗(yàn)室自制)。 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、顯色培養(yǎng)基(青島海博生物技 術(shù)有限公司)。 甘油、十二水合磷酸一氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、 氯化鉀、吐溫-20、脂肪酸甲酯磺酸鹽(分析純, 國(guó)藥集團(tuán)化 學(xué)試劑有限公司); PBS 緩沖溶液(0.01 mol/L, pH 7.4, 實(shí)驗(yàn) 室自制)。 DPX-9162B-2 電熱恒溫培養(yǎng)箱 ( 上海福瑪公司 ); YXQ-LS-50 立式壓力蒸汽滅菌鍋 ( 上海博迅公司 ); GL3202-1SCN 電子天平 ( 瑞士梅特勒 - 托利多公司 ); UNIVERSAL 320R 高速離心機(jī)(德國(guó) Hettich 公司); QL-866 旋渦振蕩器(江蘇其林貝爾公司); BSC-1500 B2 Ⅱ -X 生物安 全柜(鑫貝西 Biobase 公司); SHZ-82 恒溫振蕩器(常州潤(rùn)華 儀器公司); 磁力架(天津倍思樂公司); HH-S 恒溫水浴鍋 (金壇醫(yī)療公司); -80 ℃冰箱(中科美菱公司)、milli-Q 超純 水儀(美國(guó) Milipore 公司)。 炒青菜、雞絲花菜、紅燒肉、鹵鴨肉(河南省科高食 品安全檢測(cè)有限公司提供)。

2.2 方 法

2.2.1 蠟樣芽孢桿菌菌種活化

(1) 取出低溫保存的蠟樣芽孢桿菌菌種, 接種于營(yíng)養(yǎng) 瓊脂斜面, 37 ℃恒溫培養(yǎng)。
(2) 挑取單菌落, 接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中, 30 ℃振蕩 200 r/min, 培養(yǎng) 10 h。 取 1 mL菌液放入 1.5 mL 環(huán)氧樹脂管(epoxy pipe, EP) 中, 離心去上清, 加入新鮮培養(yǎng)基 500 μL 后, 加入等體積 的滅菌 20%的甘油, 保存于-70 ℃冰箱。

2.2.2 抗體添加量的確定

分別加入不同含量的蠟樣芽孢桿菌抗體到蠟樣芽孢 桿菌培養(yǎng)液中(稀釋至 104 CFU/mL)。取 100 μL 的細(xì)菌培養(yǎng)液加入到 100 μL 磁珠(100 mg/mL)中, 37 ℃振蕩吸附 15 min, 靜置磁力架上 2 min 分層, 棄上清液, 重復(fù)洗滌 2 次, 加入 1 mL 0.01 mol/L PBS 緩沖液振蕩重懸磁珠, 涂 于顯色培養(yǎng)基, 30 ℃培養(yǎng) 24 h 觀察。

2.2.3 免疫磁珠添加量的確定

分別取不同添加量的免疫磁珠, 加入到 1 mL 蠟樣芽 孢桿菌培養(yǎng)液中(稀釋至 104 CFU/mL), 37 ℃振蕩吸附 15 min, 靜置磁力架上 2 min 分層, 棄上清液, 重復(fù)洗滌 2 次, 加入 1 mL 0.01 mol/L PBS 緩沖液振蕩重懸磁珠, 涂 于顯色培養(yǎng)基, 30 ℃培養(yǎng) 24 h 觀察。

2.2.4 免疫磁珠與菌液最佳反應(yīng)時(shí)間

分別取偶聯(lián)磁珠 100 μL, 加入到 1 mL 蠟樣芽孢桿菌 培養(yǎng)液中, 37 ℃振蕩吸附 5、10、15、20、25 min 后, 靜置 磁力架上 2 min 分層, 棄上清液, 重復(fù)洗滌 2 次, 加入 1 mL 0.01 mol/L PBS 緩沖液振蕩重懸磁珠, 吸取 50 μL 涂于顯 色培養(yǎng)基, 30 ℃培養(yǎng) 24 h 觀察。

2.2.5 免疫磁珠分離蠟樣芽孢桿菌的敏感性試驗(yàn)

將蠟樣芽孢桿菌菌液, 按一定梯度進(jìn)行倍比稀釋。取 100 μL 免疫磁珠分別加入到 1 mL 的經(jīng)稀釋至 104 CFU/mL 的蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)液中, 37 ℃振蕩吸附 15 min, 靜置磁 力架上 2 min 分層, 棄上清液, 重復(fù)洗滌 2 次, 加入 1 mL 0.01 mol/L PBS 緩沖液振蕩重懸磁珠, 然后涂于顯色培養(yǎng) 基, 30 ℃培養(yǎng) 24 h, 觀察平板上菌落的生長(zhǎng)狀況。

2.2.6 免疫磁珠分離蠟樣芽孢桿菌的特異性試驗(yàn)

將 100 μL 免疫磁珠, 分別加入到 1 mL 蠟樣芽孢桿 菌、鼠傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、 金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸埃希氏菌和販 崎腸桿菌混合液中。37 ℃振蕩吸附 15 min, 靜置磁力架上 2 min 分層, 棄上清液, 重復(fù)洗滌 2 次, 加入 1 mL 0.01 mol/L PBS 緩沖液振蕩重懸磁珠, 然后涂于顯色培養(yǎng)基, 30 ℃培 養(yǎng) 24 h, 觀察平板上菌落的生長(zhǎng)狀況。

2.2.7 熟制樣品的檢測(cè)

分別稱取 25 g 炒青菜、雞絲花菜、紅燒肉、鹵鴨肉 為基質(zhì)樣品, 每份樣品中加入 225 mL 稀釋液, 分別接種蠟 樣芽孢桿菌(CMCC63303)(104 CFU/mL)制備樣品。充分混 勻(所有樣品均質(zhì) 2 min), 加入免疫磁珠, 37 ℃振蕩吸附 15 min, 磁分離 2 min, 取上清, 并用 PBS 洗滌。并作空白 對(duì)照, 涂于顯色培養(yǎng)基, 30 ℃培養(yǎng) 24 h, 觀察平板上菌落 的生長(zhǎng)狀況, 并計(jì)算捕獲率。

3 結(jié)果與分析

當(dāng)抗體量添加過低時(shí), 富集到的細(xì) 菌數(shù)較少, 隨著抗體量的增多, 富集到的細(xì)菌數(shù)也越來越 多。但超過了一定濃度細(xì)菌數(shù)并不增加, 所以選用蠟樣芽孢桿菌抗體添加量為 50 μg/mL。對(duì)每個(gè)稀釋度鋪板培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù), 利用蠟樣芽 孢桿菌免疫磁珠富集分離敏感性可達(dá)到 4 CFU/mL, 而直接 平板計(jì)數(shù)法(GB 4789.14-2014 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微 生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》)已經(jīng)不能檢出菌落。

4 小 結(jié)

通過對(duì)免疫磁珠添加量免疫磁珠與菌液最佳 反應(yīng)時(shí)間免疫磁珠分離蠟樣芽孢桿菌的敏感性試驗(yàn)、特異性 試驗(yàn)的研究, 確定了蠟樣芽孢桿菌免疫磁珠添加量 100 μL, 免疫磁珠與菌液最佳作用時(shí)間為 15 min, 免疫磁珠法檢測(cè) 靈敏度底限為 10-7, 相應(yīng)的細(xì)菌濃度為 4 CFU/mL, 免疫磁 珠具有較好的靈敏度和特異性。在食品基質(zhì)中能達(dá)到較好 效果。

 

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