多重PCR快速檢測方法研究(其林貝爾MTH-012使用)

近年來，食源性疾病屢見不鮮，其中主要的食源 性致病菌有沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和 蠟樣芽孢桿菌等，可導(dǎo)致腹瀉、嘔吐、痢疾等多種疾病，嚴(yán)重者可造成死亡，因此，食品產(chǎn)品中要求不得檢出。 常規(guī)微生物學(xué)方法檢測食源性致病菌，通常需要經(jīng)過 富集培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生理生化鑒定等的過程，耗時耗 力，且主觀性強(qiáng)，極易導(dǎo)致樣品菌種的流失，出現(xiàn)陰性 結(jié)果，不能及時的發(fā)現(xiàn)并控制潛在的危險。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

蠟樣芽孢桿菌 （CMCC63302）、金黃色葡萄球菌 （CMCC26003）、宋內(nèi)氏志賀氏菌（CMCC51334）、鼠傷 寒 沙 門 氏 菌 （CMCC50115）、 大 腸 埃 希 氏 菌（CM－ CC44752）、銅綠假單胞菌（CICC21636）、蘇云金芽孢桿 菌（CICC22945）、綠膿桿菌（CMCC10110）、阪崎腸桿菌 （ATCC51024）、副溶血性弧菌（CICC21617）、變形桿菌 （CMCC49027）、單增李斯特菌（CMCC54001），均保存 于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實驗室。 1.1.2 試劑 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：北京陸橋生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖：北京全式金生物公司；agar：索萊寶生物科技有 限公司；細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒：天根生化科技有限公司；2×Es Taq MasterMix（Dye）：康為世紀(jì)生物科 技有限公司；50 bp DNA Ladder：中科瑞泰生物科技有 限公司；ddH2O：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程實驗室制備。

1.2 儀器與設(shè)備

其林貝爾MTH-012 型旋渦混合儀：海門其林貝爾儀器制造有限公司；070-851 型 PCR 儀：德國 Biometra 公司； DYY-10 C 型電泳儀：北京市六一儀器廠；JY04S-3E 型 凝膠成像分析系統(tǒng)：北京科普爾科技發(fā)展有限公司； UV-1700 型紫外分光光度計：上海優(yōu)尼科公司；K5500 型超微量核酸測量儀：北京凱奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)

分別挑取蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀 氏菌、沙門氏菌的單菌落，接種于 8 mL 滅菌的營養(yǎng)肉 湯培養(yǎng)基，37 ℃搖床 180 r/min 過夜培養(yǎng)。

1.3.2 模板的制備及計數(shù)

取 1 mL 過夜培養(yǎng)菌液，提取基因組 DNA 為模板， 具體操作方法見細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒說明書。 用核酸測定儀對 DNA 濃度及純度進(jìn)行測定。另取 1 mL 菌液，10 倍梯度稀釋，涂布于固體肉湯培養(yǎng)基中， 37 ℃過夜培養(yǎng)，進(jìn)行平板計數(shù)。

1.3.3 引物的設(shè)計與合成

針對蠟樣芽孢桿菌的 gyrB、nheA 基因，金黃色 色葡萄球菌的 nuc、SED、MecA基因、志賀氏菌的 ipaH 基因和沙門氏菌的 ttr、sal、SiiA 基因，共設(shè) 計了 11 套引物，引物由上海生工公司合成，引物序列 及擴(kuò)增片段長度等。

1.3.4 引物的篩選和確定

以11對引物分別對 4 種目的菌進(jìn)行擴(kuò)增，單一PCR 反應(yīng)體系為：2×Es Taq Master Mix（Dye） 5 μL、20 μmol/L 上 下 游 引 物 各 0.2 μL，DNA 模 板 0.8 μL，加 ddH2O 補(bǔ)足到 10 μL。單一 PCR 反應(yīng)程序 為：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃ 變性 30 s，梯度設(shè)置退火 溫度，退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，72 ℃再延伸 7 min，反 應(yīng) 30 個循環(huán)。對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，選擇擴(kuò) 增條帶單一且大小不同、退火溫度相似的引物，確定 為多重 PCR 引物組。

2 結(jié)果與分析

蠟樣芽孢桿菌 gyrB 引物對在 52.5、55.7 ℃范圍內(nèi)條帶明顯，片段長 246 bp；金黃色葡萄球 菌 nuc 引物對在 52.5 ℃處有單一明亮條帶，片段長 166 bp；志賀氏菌的 ipaHⅠ引物對在 52.6 ℃處單一明 亮條帶，片段長 210 bp，ipaH Ⅲ引物對在退火范圍內(nèi) 條帶單一，片段長 65 bp；沙門氏菌 SiiA 引物對在梯度 退火溫度下條帶單一明亮，片段長 107 bp，退火溫度 相近且擴(kuò)增出的片段長度不同，有利于多重 PCR 擴(kuò) 增結(jié)果的判斷，最終選擇 gyrB、nuc、ipaHⅢ、SiiA 引物 對為多重 PCR 反應(yīng)的引物組。當(dāng)退火溫度在這個范圍內(nèi)間均能得 到 4 條目的帶，且條帶區(qū)間明顯，故證明本研究建立的 多重 PCR 體系，可特異性擴(kuò)增出目的條帶，且其大小 與預(yù)期擴(kuò)增基因片段大小一致，但在 53.9 ℃之前條帶 略暗，退火溫度為 53.9 ℃ 時條帶更加清晰明亮，因此，選定 54 ℃作為多重 PCR 的最適退火溫度。但多重 PCR 擴(kuò)增的志賀氏菌 65 bp 與金黃色葡萄球菌 166 bp 條帶相對暗一些，故對 4 組引物對的加入量進(jìn)行優(yōu)化。測得 1mL 蠟樣芽孢桿菌的核酸濃度為 52.649ng/μL， 對應(yīng)菌落濃度為 1.5×107 CFU/mL；1mL 金黃色葡萄球菌的 核酸濃度為 14.245 ng/μL，對應(yīng)菌落濃度為 108CFU/mL； 1 mL 志賀氏菌的核酸濃度為 357.78 ng/μL，對應(yīng)菌落 濃 度 為 108 CFU/mL；1 mL 沙門氏菌的核酸濃度為 108.32 ng/μL，對應(yīng)菌落濃度為 1.05×108 CFU/mL。用 ddH2O 10 倍梯度稀釋提取的 DNA 模板，取 0.8 μL 進(jìn) 行多重 PCR，測定其檢出限。

3 討論

目前，普通 PCR 技術(shù)在食品檢測、疾控檢測中， 已經(jīng)相當(dāng)成熟，相對于傳統(tǒng)的生化特性檢測，有著快 速、特異、靈敏度高的特點。在簡單的 PCR 基礎(chǔ)上，多 重 PCR 融合了普通 PCR 方便、快捷的優(yōu)點，加入多個 引物對，可進(jìn)行多個菌種多個樣品的快速分析，簡單 易操作，無需昂貴的儀器和專業(yè)的實驗人員，也可進(jìn) 行準(zhǔn)確的分析，為快速發(fā)展的食品檢測行業(yè)，提供了 很好的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。由于多重 PCR 是在同一反 應(yīng)下進(jìn)行的，節(jié)約成本，因此相對于常規(guī)的單重 PCR 來說，大大縮短的檢測時間，提高了檢測效率。食 品檢測的快速發(fā)展，多重 PCR 方法以其特異性強(qiáng)、靈 敏度高等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的快速檢 測中。



 

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