大鼠腸黏膜損傷的修復(fù)作用研究（Vortex-5使用）

腫瘤是危害全人類健康的常見疾病和多發(fā)疾病，目 前臨床上常用的腫瘤治療策略主要有手術(shù)、化療、分子 靶向抑制劑以及生物藥療法，常規(guī)化療仍然是臨床治療 腫瘤的主要方式。其中，以5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）為代表的抗代謝類化療藥在化療中占據(jù)約 40％的比重 。5-FU作為最早應(yīng)用的抗代謝類化療藥， 已在臨床上廣泛用于胃腸道癌、肝癌和胰腺癌等實體 腫瘤的治療，尤其在消化道腫瘤的治療上占據(jù)主導(dǎo)地位 。

1 材料

1.1 儀器

Max190全波長酶標(biāo)儀（美國Spectra公司）；L420離 心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；TANKPE060 純水儀 （美國 Millipore 公司）；BSA224S-CW 電子天平[賽多利 斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；Vortex-5 渦旋混勻儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；EG1150C石蠟包埋 儀（德國徠卡公司）；2000-C倒置顯微鏡、V.A1倒置熒光 顯微鏡（德國Zeiss公司）。

1.2 藥品與試劑

人工蟬花由本實驗室栽培，由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院于瑞蓮副教授鑒定為蟬花（Isaria cicadae Miquel）菌 種的人工栽培品；5-FU注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司， 批號：1605081，規(guī)格：0.25 g/10 mL）；大鼠內(nèi)毒素（ET）酶 聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號：H03A8E48592）、D乳酸（D-LA）ELISA試劑盒（批號：H02F4E48101）、分泌型 免疫球蛋白（sIgA）ELISA試劑盒（批號：H13C3E76192）、 腫 瘤 壞 死 因 子 α（TNF-α）ELISA 試 劑 盒（批 號 ： H06A2E50672）、γ-干擾素（IFN-γ）ELISA 試劑盒（批號： H06F6E23206）、白細(xì)胞介素15（IL-15）ELISA試劑盒（批 號：H03A3F06703）、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）ELISA試劑盒（批號：H05A7E46872）、髓過氧化物酶（MPO） ELISA 試劑盒（批號：H03F8E34274）、丙二醛（MDA） ELISA 試劑盒（批號：H04A6E40382）、閉鎖小帶蛋白 ZO-1 ELISA 試劑盒（批號：H03A2E78452）均購自上海 源葉生物科技有限公司；DAPI染色液（南京建成生物有 限公司，批號：SUB- 30162）；兔源緊密連接蛋白Claudin 1-一抗（批號：ab240400）；山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）二 抗（批號：ab150077）均購自美國Abcam公司。

1.3 動物

SPF級健康SD大鼠40只，♂，體質(zhì)量（215±35）g， 由南京市青龍山動物繁殖場提供，動物生產(chǎn)許可證號： SCXK（蘇）2017-0008。所有大鼠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大 學(xué)實驗動物房內(nèi)，環(huán)境溫度為（23±2）℃、12 h/12 h晝夜 循環(huán)。飼養(yǎng)期間大鼠自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后 進(jìn)行實驗。本實驗遵守《實驗動物護(hù)理和使用指南》，符 合動物常規(guī)倫理。

2 方法

2.1 動物分組與造模

將40只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和人工蟬 花高、中、低劑量組，每組8只。除正常組外，模型組和人 工蟬花各劑量組大鼠均每天腹腔注射 1 次 30 mg/kg 的 5-FU，正常組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，持續(xù)注射5 d。在此同時，人工蟬花高、中、低劑量組大鼠在注射 5-FU后1 h分別灌胃3.5 、1.75 、0.875 g/kg的人工蟬花溶 液（將干燥人工蟬花粉末用生理鹽水制備的懸液，劑量 根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果和本實驗室前期研究報道設(shè)置），正常 組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水；各組大鼠均每天 給藥 1 次，連續(xù)給藥 8 d，記錄大鼠體質(zhì)量等一般情況 變化。

2.2 血清中ET、D-LA含量測定

末次給藥后2 h，大鼠腹主動脈取血，室溫靜置1 h，凝固收縮后，3 000 r/min 離心 10 min，分離血清，然后 于－20 ℃保存，備用。按相應(yīng)試劑盒說明書操作，檢測 血清中 ET、D-LA 的含量，考察其對小腸黏膜生物屏障 功能的影響。

2.3 血清中sIgA、TNF-α、IFN-γ、IL-15含量測定

取“2.2”項下血清，按相關(guān)試劑盒說明書操作，對血 清中sIgA、TNF-α、IFN-γ、IL-15的含量進(jìn)行測定，考察其 對小腸黏膜免疫功能的影響。

2.4 血清中MPO活性測定

取“2.2”項下血清，按試劑盒說明書操作，對血清中 G-CSF的含量進(jìn)行測定。大鼠取血后，腹腔解剖取小腸 組織約40 mg勻漿[組織與生理鹽水比為1 ∶ 10（mg/mL）]， 用于試劑盒檢測，剩余部分病理組織檢查待用。按檢測 試劑盒說明書操作，對小腸組織中MPO活性進(jìn)行測定， 考察其對小腸炎癥因子的影響。

2.5 小腸組織中MDA含量測定

取“2.4”項下小腸組織，按檢測試劑盒說明書操作， 對小腸組織中MDA的含量進(jìn)行測定，考察其對小腸組 織過氧化水平的影響。

2.6 小腸黏膜病理學(xué)觀察

將小腸于10％多聚甲醛溶液固定24 h，然后進(jìn)行常 規(guī)組織包埋、石蠟切片等操作，經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色 后顯微鏡下觀察小腸黏膜病理變化。

3 結(jié)果

給藥前，各組大鼠間體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。給藥 8 d 后，與正常組比較，模型組大鼠體 質(zhì)量顯著降低（P＜0.01），此外還出現(xiàn)了明顯的食欲不 振、精神萎靡、活力下降等癥狀。與模型組比較，人工蟬 花高劑量組大鼠體質(zhì)量均顯著升高（P＜0.01），食欲不 振、精神萎靡等情況也得到明顯改善。與正常組比較，模型組大鼠血清中 ET、D-LA 含量 顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，人工蟬花高、中、 低劑量組大鼠血清中 ET、D-LA 含量均顯著降低（P＜ 0.05或P＜0.01），且呈劑量依賴性趨勢。與正常組比較，模型組大鼠小腸組織中MDA含量 顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，人工蟬花高、中、 低劑量組大鼠小腸組織中 MDA 含量顯著降低（P＜ 0.01），并呈劑量依賴性趨勢。正常組大鼠腸腔絨毛形態(tài)完整，隱窩結(jié)構(gòu)清晰。模 型組大鼠腸絨毛剝落明顯，隱窩結(jié)構(gòu)散亂，可觀察到大 量炎性細(xì)胞聚集，腸黏膜損傷嚴(yán)重。與模型組比較，人 工蟬花高、中、低劑量組大鼠的腸腔絨毛和隱窩結(jié)構(gòu)形 態(tài)較完整，損傷程度較小；其中，人工蟬花高劑量、中劑 量組大鼠腸絨毛已接近正常，人工蟬花高劑量組大鼠隱 窩結(jié)構(gòu)較為緊密、完整，人工蟬花低劑量組大鼠小腸組 織隱窩結(jié)構(gòu)雖較正常組有一定程度的破壞、中性粒細(xì)胞聚集，但相比于模型組結(jié)構(gòu)仍較好。

4 討論

正常的腸道黏膜屏障由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫 屏障和生物屏障共同組成。通過對腸黏膜病理切片的 觀察，發(fā)現(xiàn)5-FU化療之后，大鼠小腸絨毛和隱窩結(jié)構(gòu)均 受到了嚴(yán)重的損傷，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受到嚴(yán)重的影 響，機(jī)體無法正常地進(jìn)行營養(yǎng)吸收，表現(xiàn)為體質(zhì)量下降 和血清中ET含量顯著升高。D-LA是腸道細(xì)菌代謝、裂 解的產(chǎn)物，當(dāng)腸道缺血時，腸黏膜生物屏障破壞，此時腸 道中細(xì)菌產(chǎn)生的大量D-LA，通過受損的腸黏膜經(jīng)循環(huán) 進(jìn)入血液，檢測血中D-LA水平可以反映腸黏膜受損程 度和通透性變化。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清 中D-LA含量顯著升高，灌胃人工蟬花后，腸黏膜得到明 顯保護(hù)，血清中ET和D-LA含量均顯著降低，并且大鼠 因化療造成的體質(zhì)量下降的情況也有顯著的改善，表明 人工蟬花對5-FU化療后破壞的腸黏膜營養(yǎng)吸收以及腸 黏膜生物屏障有明顯的保護(hù)作用。



 

免責(zé)聲明：文章僅供學(xué)習(xí)和交流，如涉及作品版權(quán)問題需要我方刪除，請聯(lián)系我們，我們會在第一時間進(jìn)行處理。