其林貝爾漩渦混合器用于納米膠束表面抗體偶聯(lián)

聚合物膠束（polymeric micelles，PMs）作為載體在靶向治療領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。納米級聚合物膠 束（簡稱聚合物納米膠束）作為載體能夠通過被動靶 向、主動靶向及物理化學(xué)敏感等方式遞送藥物至靶 位并控制釋藥，用于各類疾病的診斷和治療。

1 材料與方法

1． 1 細(xì)胞

肝癌細(xì)胞 SNU-423 由山西醫(yī)科大學(xué)山 西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1． 2 主 要 試 劑 及 儀 器

RPMI Medium Modified、 DMEM ／ HIGH GLUCOSE 購自美國 HyClone 公司； 胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司； DMPE-PEG-Maleimide、DPPE-PEG-Maleimide、DSPEPEG-Maleimide、DOPE-PEG-Maleimide、DLPE-PEGMaleimide 購自美國阿拉丁工業(yè)公司；FITC 標(biāo)記的 Goat Anti-Rabbit IgG HL、Anti-GOLPH2 antibody 購 自英國 Abcam 公司；VORTEX-5 漩渦混合器購自海 門市其林貝爾儀器制造有限公司；UP-250 超聲波細(xì) 胞粉碎機(jī)購自寧波新芝生物科技股份有限公司； FCM 購自美國 BD 公司。

1． 3 空載聚合物納米膠束的制備

分別精確稱取10． 00 mg 的 DMPE-PEG-Maleimide、DPPE-PEG-Maleimide、DSPE-PEG-Maleimide、DOPE-PEG-Maleimide 及 DLPE-PEG-Maleimide，置于 5 mL 離心管中，逐滴 加入 2 mL 無菌的 PBS 溶液，置漩渦混合器上充分 渦旋溶解，靜置 5 min；超聲 3 次，每次 10 s，靜置 5 min；經(jīng) 0． 22 μm 濾膜過濾，獲得 5 種試劑的空載 聚合物納米膠束。

1． 4 空載聚合物納米膠束與 Anti-GOLPH2 抗體偶聯(lián)

無菌環(huán)境下，取 5 mL 離心管，分別加入 5 種空載聚合 物納米膠束，每管中加入 0． 647 mg ／ mL Anti-GOLPH2 抗體，使抗體終濃度分別為 2． 5、5． 0、7． 5 μg ／ mL， 置25 ℃，120 r ／ min 搖床孵育 12 h。

1． 5 SNU-423 細(xì)胞膜表面 GOLPH2 抗原表達(dá)量的檢測

1． 5． 1 細(xì)胞分組

取對數(shù)生長期的 SNU-423 細(xì)胞， 均勻接種于 6 孔板，待細(xì)胞長至 80％ ～ 90％時(shí)，消化 收集細(xì)胞，移入 5 mL 的無菌離心管中，335 × g 離心 5 min；用 2 mL PBS 洗滌 2 次，調(diào)整離心管中細(xì)胞的 濃度為 1 × 106 個(gè) ／ mL。將細(xì)胞分為對照組及實(shí)驗(yàn) 組，對照組為 Goat Anti-Rabbit IgG HL 孵育過的細(xì) 胞；實(shí)驗(yàn)組為經(jīng) Anti-GOLPH2 抗體標(biāo)記 Goat AntiRabbit IgG HL 孵育過的細(xì)胞。

1． 5． 2 孵育

Anti-GOLPH2 抗體 將 Anti-GOLPH2 抗體用 PBS 按 1 ∶ 1 000 稀釋。僅將實(shí)驗(yàn)組 SNU-423 細(xì)胞離心，棄上清，收集細(xì)胞沉淀，每個(gè)離心管中分 別加入 0、2． 5、5． 0 和 7． 5 μg ／ mL Anti-GOLPH2 抗 體，重懸細(xì)胞，混勻，室溫下避光孵育 2 h；335 × g 離 心 5 min；回收含 Anti-GOLPH2 抗體的上清液，細(xì)胞 沉淀用 PBS 洗滌 2 次，335 × g 離心 5 min，收集細(xì) 胞沉淀。

1． 5． 3 孵育

FITC 標(biāo)記的 Goat Anti-Rabbit IgG HL 對照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞沉淀中分別加入 Goat AntiRabbit IgG HL（1 ∶ 500 稀釋），室溫避光孵育 30 min； 335 × g 離心 5 min；收集上清，留存細(xì)胞沉淀用 PBS 洗滌 2 次，再用適量 PBS 重懸。采用 FCM 檢測對照 組及實(shí)驗(yàn)組 SNU-423 細(xì)胞中異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）熒光強(qiáng)度。

1． 6 SNU-423 細(xì)胞與偶聯(lián)有

Anti-GOLPH2 抗體的 空載聚合物納米膠束共同孵育 用 6 孔 板 培 養(yǎng) SNU-423 細(xì)胞，每孔細(xì)胞增殖至 80％時(shí)，用 0． 25％ 胰蛋白酶消化，335 × g 離心 5 min，收集細(xì)胞，PBS 洗滌 2 次。將 Anti-GOLPH2 抗體用無血清培養(yǎng)基按 1 ∶ 1 000 稀釋，取適量抗體稀釋液重懸細(xì)胞沉淀，置 25 ℃，120 r ／ min 搖床孵育 2 h；335 × g 離心 5 min； 收集上清；留存細(xì)胞沉淀經(jīng) PBS 洗滌 2 次，用 3 mLPBS 重懸細(xì)胞，335 × g 離心 5 min；棄上清，加入偶 聯(lián)有 Anti-GOLPH2 抗體的空載聚合物納米膠束培養(yǎng) 液混懸，置 25 ℃，120 r ／ min 搖床孵育 6 h。

2 結(jié) 果

SNU-423 細(xì)胞膜表面的 GOLPH2 抗原相對表達(dá)量 ［實(shí)驗(yàn)組（6． 96％）與對照組（5． 73％）的差值］為 1． 23％。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞膜表面 GOLPH2 陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F ＝ 6． 91，P ＞ 0． 05）。 見圖 1 和圖 2。

各類聚合物納米 膠束經(jīng)不同濃度的 AntiGOLPH2 孵育后，其 FITC 熒光強(qiáng)度與 Anti-GOLPH2 濃度呈正相關(guān)；在相同的 Anti-GOLPH2 濃度下，各 類聚合物納 米 膠 束 與 Anti-GOLPH2 的 偶 聯(lián) 效 率 存 在 明 顯 的 差 異。其 中 DLPE-PEG-Maleimide 與 DPPE-PEG-Maleimide、DMPE-PEG-Maleimide、DSPEPEG-Maleimide，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F ＝ 6． 72，P ＜ 0． 05）。

3 討 論

聚合物納米膠束作為兩親性材料，在水相中能 自組裝成核-殼式結(jié)構(gòu)，即疏水性內(nèi)核和親水性外殼 組成。其中疏水性內(nèi)核能夠包載難溶性的藥物，以 提高其穩(wěn)定性和生物利用度。而親水性外殼則 影響著聚合物納米膠束在體內(nèi)的穩(wěn)定性、循環(huán)動力 學(xué)及體內(nèi)積累等表征。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）具有無毒、水溶性好、靈活性高等特性， 被廣泛地用于聚合物納米膠束的親水段。 在主動靶向載體合成的過程中，可先將配體與 含 PEG 的聚合物納米材料進(jìn)行偶聯(lián)，再連接于其他 類細(xì)胞膜的載體上。本研究將 Anti-GOLPH2 antibody 與含 PEG 的聚合物納米膠束共同孵育，使其彼 此偶聯(lián)，再使其與 SNU-423 細(xì)胞膜進(jìn)行耦合，通過 FITC 標(biāo)記抗體特異性的結(jié)合 Anti-GOLPH2 antibody， 應(yīng)用 FCM 可較為靈敏地捕獲微量的抗體與 FITC 結(jié) 合所發(fā)出的熒光。



 

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