用XW-80A對酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌研制

1 材料與方法 

1． 1 藥品和儀器 

酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌購 于山東科興生物制品公司; 米非司酮由深圳市資福 藥業(yè)有限公司提供; Hamster Anti-mouse CD3e FITC、 Ｒat Anti-Mouse CD4 PE-CYTM5、Ｒat Anti-Mouse CD8a PE-CYTM7 ( 美 國 BD Pharminge 公 司) ; Anti-Mouse CD279 PE、Anti-Mouse CD28 PE( 美國 e Bioscience 公司) ; 小鼠紅細(xì)胞裂解液( Biosharp 公司) ; 高速低 溫離心機、各種規(guī)格移液器( 美國 Thermo Fisher 公 司) ; Beckman Coulter FC500 流 式 細(xì) 胞 儀 ( 美 國 Beckman Coulter 公司) ; 臺式低速離心機( 湘儀離心 機器械廠) ; XW-80A 旋渦混合儀( 海門市其林貝爾儀器制造公司) 。 

1． 2 動物 

8 周齡 SPF 級 BALB /c 健康成年小鼠 ( 雌性 18 只，雄性 9 只) ，體質(zhì)量 18 ～ 22 g( 江蘇省 南京市青龍山動物飼養(yǎng)中心提供) ，雌雄小鼠采用 2 ∶ 1 配對飼養(yǎng)。 

1． 3 早產(chǎn)及足月小鼠造模 

用米非司酮( ＲU486) 腹腔注射無菌孕鼠建立早產(chǎn)模型。雌鼠檢查到 陰栓記為妊娠第 1 天，單籠飼養(yǎng)，隨機選擇部分孕鼠 于孕第 18 天及第 19 天晨 8 點腹腔注射用蓖麻油溶 解的米非司酮( 劑量 0． 15 mg /kg，) ，獲得胎齡 ＜ 20 d 的新生早產(chǎn)小鼠。另外的孕鼠待其自然分娩，收 集胎齡 ＞ 20 d 的新生足月小鼠。 

1． 4 分組及給藥 

隨機將 P1 早產(chǎn)小鼠分為早產(chǎn)實 驗組( Ⅰ組) 和早產(chǎn)對照組( Ⅱ組) ，同日齡足月小鼠 為足月對照組( Ⅲ組) ，每組 16 只。Ⅰ組給予酪酸 梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌灌胃 ( 灌胃體積為 100μL /10g) ，同一時間，給予Ⅱ組與Ⅲ組等量生理鹽水 灌胃，均于灌胃后按窩返回母鼠身邊飼養(yǎng)。 

1． 5 取血 

各組分別在 P14、P21 隨機選取小鼠 8 只，乙醚麻醉，眼球取血法取血 ＞ 500 μL，EDTA-K2 抗凝后，置于冰上備用。 

1． 6 CD28 和 PD1 分子檢測 

取 2 只流式管分別 標(biāo)為①、②，向兩管中各加入 100 μL stain buffer、熒 光標(biāo)記的抗體 CD3e-FITC、CD4-PEcy5、CD8-PEcy7 各 1 μL; 再向①管中加入 1 μL CD279-PE，②管加入 1 μL CD28-PE; 兩管中各加入外周血 100 μL，避光 孵育 20 min; 兩管分別加入鼠紅細(xì)胞裂解液 2 mL， 裂解 2 min，1500 rpm 離心 5 min，重復(fù) 1 次; 兩管加 stain buffer 各 2 mL，1500 rpm 離心 5 min，倒去上清 液，重復(fù) 1 次; 兩管加 stain buffer 各 700 μL 后上機 檢測; 采用 Flow Jo VX 軟件進(jìn)行 CD28、PD1 的表達(dá) 量分析。 

1． 7 統(tǒng)計方法 

采用 GraphPad Prism 6． 0 軟件進(jìn) 行統(tǒng)計分析，用 Holm-Sidak 檢驗進(jìn)行多組間兩兩比 較，兩組間、組內(nèi)比較用獨立樣本 t 檢驗。P ＜ 0． 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果 

2． 1 早產(chǎn)對小鼠 CD4 + T 細(xì)胞表面 CD28 表達(dá)水平 的影響 

為新生小鼠 CD4 + T 細(xì)胞 表面 CD28 表達(dá)圖。在 P14，Ⅱ組小鼠 CD4 + T 細(xì)胞 表面 CD28 的表達(dá)與Ⅲ組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P = 0． 073) ; 而在 P21，Ⅱ組 CD28 的表達(dá)量高于Ⅲ組 ( P = 0． 040) 。并且Ⅱ組 CD28 的表達(dá)量隨 日齡的增加而升高( P = 0． 024) ; 而Ⅲ組 CD28 的表 達(dá)隨著時間的延長未見明顯變化( P = 0． 108) 。 

2． 2 早產(chǎn)對小鼠 CD4 + T 細(xì)胞表面 PD1 表達(dá)水平的影響 

新生小鼠 CD4 + T 細(xì)胞 表面 PD1 表達(dá)圖。在 P14，Ⅱ組小鼠 CD4 + T 細(xì)胞表面 PD1 的表 達(dá) 與Ⅲ組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P = 0． 225) ; 而在 P21，早產(chǎn)對照組 PD1 的表達(dá)量高于Ⅲ 組( P =0． 000) 。并且Ⅱ組 PD1 的表達(dá)量隨 日齡的增加升高( P = 0． 000) ; 而Ⅲ組 PD1 的表達(dá)隨 著時間的延長未見明顯變化( P =0． 393) 。

2． 3 酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌對早產(chǎn)小鼠 CD4 + T 細(xì)胞表面 CD28 表達(dá)的影響 

在 P14 和 P21，Ⅰ組 CD4 + T 細(xì)胞表面 CD28 的表達(dá)均 高于Ⅱ組( t = 6． 784，t = 4． 577，P 均 = 0． 000) 和Ⅲ 組( t = 4． 315，t = 6． 746，P 均 = 0． 000) 。 而Ⅰ組 CD28 的表達(dá)在 P14 與 P21 未見明顯差異( t= 1． 567，P = 0． 139) 。

3 討論 

酪酸梭菌雙岐桿菌二聯(lián)活菌是酪酸梭狀芽孢桿嬰兒型雙歧桿菌混合制劑，可以促進(jìn)腸道有益 菌的生長，維持腸道菌群的平衡，對腸道內(nèi)病原菌的 抑制有顯著作用。Ling 等發(fā)現(xiàn)酪酸梭菌雙歧 桿菌混合物可能是治療抗生素相關(guān)性腹瀉( AAD) 的一種簡單有效的方法。有臨床研究表明，肺炎 住院兒童在應(yīng)用抗生素的基礎(chǔ)上加用酪酸梭菌雙岐 桿菌二聯(lián)活菌，可有效降低其發(fā)生 AAD 的風(fēng)險，未發(fā)現(xiàn)其不良反應(yīng)。

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