察哈爾羊肌肉品質(zhì)的重要分子研究（QL-901渦旋儀

察哈爾羊生長于內(nèi)蒙古錫林郭勒盟正鑲白旗、鑲黃 旗和鑲藍(lán)旗地區(qū)，其母本為內(nèi)蒙古地區(qū)的細(xì)毛羊，父本 為德國進(jìn)口的美利奴羊，是我國自上世紀(jì)90年代開始培 育的肉毛兼用綿羊新品種。察哈爾羊4～6 月齡生長較 快，6～18 月齡日增體質(zhì)量開始降低，其日增體質(zhì)量最 高可達(dá)166.17 g，產(chǎn)肉性能較高。察哈爾羊羊肉肉嫩多 汁，脂肪含量適中，必需脂肪酸亞油酸含量較高，具有 較高的營養(yǎng)價(jià)值和保健作用。蛋白質(zhì)是肌肉的重要組成 部分，其發(fā)生改變會(huì)引發(fā)肌肉質(zhì)量的轉(zhuǎn)變。不同部位 肌肉的理化特性及蛋白質(zhì)組成不同。肉色、系水力、 肌內(nèi)脂肪含量、pH值及嫩度等肉質(zhì)評估標(biāo)準(zhǔn)會(huì)受到肌纖 維含型及比例的影響。

1 材料與方法 

1.1 材料與試劑 

實(shí)驗(yàn)樣本由同一放牧條件下生長狀況良好的3 只6 月 齡察哈爾公羊作為生物重復(fù)，分別采集3 只羊的背最長肌 和臀肌。 蛋白裂解液、尿素、胰蛋白酶、碘乙酰胺、二硫蘇 糖醇、碳酸氫銨 美國賽默飛世爾公司；BCA蛋白濃度 測定試劑盒 北京碧云天生物科技有限公司。 

1.2 儀器與設(shè)備

－80 ℃冰箱 海爾集團(tuán)公司；98-111N超聲粉 碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Z323K低溫離 心機(jī) 德國Hermle公司；QT-901渦旋儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Eksigent nanol 400液相色譜儀、 TOF-5600質(zhì)譜儀 美國AB Sciex公司。 

1.3 方法 

1.3.1 總蛋白提取 

將肌肉樣本于液氮中研磨成粉末后，取0.8 g于離心 管中，加入1 g/100 mL十二烷基硫酸鈉裂解液，每隔1 min 在渦旋儀上渦旋30 s，20 min后結(jié)束；將樣品用超聲儀破 碎2 min后，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清；使用 BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行總蛋白濃度測定。 

1.3.2 總蛋白酶解 

取蛋白含量100 μg的樣品，加入200 μL 8 mol/L 尿素、10 mmol/L二硫蘇糖醇的混合溶液，37 ℃變性 1 h，12 000 r/min離心40 min，加入200 μL尿素，振蕩、 12 000 r/min離心30 min，重復(fù)2 次；加入200 μL 50 mmol/L 碘乙酰胺避光反應(yīng)30 min，12 000 r/min離心30 min； 加入100 μL 100 mmol/L碳酸氫銨，12 000 r/min離心 20 min，重復(fù)3 次；加入適量胰酶37 ℃孵育過夜，12 000 r/min離心30 min；加入50 μL 100 mmol/L碳酸氫 銨，12 000 r/min離心30 min，重復(fù)2 次；收集濾液，凍 干，備用。 

1.3.3 總蛋白鑒定 

用50 μL體積分?jǐn)?shù)2%乙腈水溶液復(fù)溶酶解后的凍干 粉，利用數(shù)據(jù)信息依賴性獲?。╥nformation dependent acquisition，IDA）與SWATH方法上機(jī)鑒定總蛋白與差異 蛋白。離子源：IDA掃描正離子模式，噴霧電壓2.3 kV， 離子源溫度150 ℃。蛋白鑒定方式：一級掃描方式： 全掃描；一級掃描范圍：m/z 150～1 200；質(zhì)譜分辨率設(shè) 為30 000；窗口0.4 Da；碎裂方式：誘導(dǎo)碰撞解離；碎 裂能量：動(dòng)態(tài)碎裂；二級掃描范圍：m/z 100～1 500；循 環(huán)方式：動(dòng)態(tài)排除掃描；動(dòng)態(tài)排除時(shí)間18 s；SWATH定 量方式：一級掃描方式：全掃描；一級掃描范圍：m/z 150～1 200；質(zhì)譜分辨率設(shè)為30 000；間隔窗口25 u（如 m/z 400～425、424～449、448～473,…,1 175～1 200）； 碎裂方式：誘導(dǎo)碰撞解離；碎裂能量：動(dòng)態(tài)碎裂；二級 掃描范圍：m/z 100～1 500；循環(huán)方式：依次均勻掃描。 

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析 

1.4.1 蛋白質(zhì)鑒定 

利用Protein Pilot 4.5軟件（AB Sciex公司）對采 集的背最長肌和臀肌IDA數(shù)據(jù)進(jìn)行搜庫，蛋白數(shù)據(jù) 庫來源于Uniprot/Swiss-Prot（https://www.uniprot.org/ uniprot/?query=reviewed:yes）。 保留時(shí)間校準(zhǔn)：利用PeakView 4.5軟件（AB Sciex公 司）對背最長肌和臀肌的SWATH數(shù)據(jù)與IDA數(shù)據(jù)進(jìn)行比 對，進(jìn)行保留時(shí)間校準(zhǔn)，做定量分析。 

1.4.2 差異蛋白的篩選 

通過LOG2（Fold Change）與－LOG10（P Value） 值繪制火山圖，且應(yīng)用Marker View軟件（AB Sciex公 司），以P Value＜0.05、Fold Change＞2或＜0.5作為閾 值篩選背最長肌和臀肌的差異蛋白。 

1.4.3 GO（gene ontology）富集分析 

使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https:// david.ncifcrf.gov/）功能注釋一欄對總蛋白和差異蛋白 分別在細(xì)胞學(xué)組分、分子功能及生物學(xué)過程方面進(jìn)行分 類，使用默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行注釋。 

1.4.4 差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用在線生物信息網(wǎng)站String（https://string-db.org/） 進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析，String網(wǎng)站包含蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)相 互作用的豐富信息。首先將蛋白質(zhì)全稱上傳到String 10.5 以獲取蛋白質(zhì)互作信息，所需的最低互動(dòng)分?jǐn)?shù)設(shè)置為中 等置信度（0.7），最后導(dǎo)入到Cytoscape 3.4.0軟件中制作 視覺蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

以UniProt/Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫為背景，對總蛋白 進(jìn)行鑒定，初步建立察哈爾羊蛋白質(zhì)表達(dá)譜。由圖1可 知，1%假陽性條件下，背最長肌和臀肌中共檢測到蛋白 質(zhì)1 073 個(gè)，其中背最長肌中共檢測到877 個(gè)，臀肌中共 檢測到897 個(gè)，2 個(gè)部位的總蛋白數(shù)量相近。對察哈爾羊肌肉總蛋白進(jìn)行GO組分富集分析，由 圖2可知：在細(xì)胞組分中，富集于細(xì)胞外外泌體中的蛋白 質(zhì)數(shù)量最多，其次富集于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)數(shù)量較多； 在分子功能中，蛋白質(zhì)主要參與聚RNA結(jié)合、ATP結(jié)合 和鈣離子結(jié)合等功能；在生物學(xué)過程中，蛋白質(zhì)主要參 與三羧酸循環(huán)、蛋白質(zhì)結(jié)合和細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)等生物 學(xué)過程。

3 討 論 

蛋白質(zhì)是動(dòng)物生理功能的體現(xiàn)者，可以從蛋白質(zhì)組 學(xué)的角度分析與肉質(zhì)相關(guān)的問題，并期望有效控制肌肉 質(zhì)量。根據(jù)Doherty等的研究，蛋白質(zhì)成分的變化可 能引起肌肉嫩度的變化。如今，蛋白質(zhì)組學(xué)常用于多組 樣品之間的蛋白質(zhì)鑒定，篩選與肌肉品質(zhì)相關(guān)的差異蛋白。本研究利用IDA和SWATH技術(shù)，對察哈爾羊背 最長肌和臀肌蛋白質(zhì)組進(jìn)行定性及相對定量分析，挑選 背最長肌中的樞紐差異蛋白，并對其進(jìn)行功能分析。

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