析奈非那韋抗多發(fā)性骨髓瘤作用(渦旋振蕩器使用

奈非那韋( nelfinavir) 是 HIV 蛋白酶的選擇 性、競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制劑，廣泛用于艾滋病的治療。 目前研究表明，奈非那韋還可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、 自噬和細(xì)胞凋亡，延緩癌細(xì)胞生長(zhǎng)，能夠抑 制 MM 細(xì)胞活性，與硼替佐米聯(lián)合用藥已用于 MM 臨床試驗(yàn)。但是其抗 MM 作用靶蛋白 還不明確，作用機(jī)制尚未得到解析。

1 儀器與材料

 CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱( 美國(guó) Thermo 公司) ，冷凍 離心機(jī)( 美國(guó) Thermo 公司) ，磁珠分離裝置( 上海 羧菲生物醫(yī)藥科技有限公司) ，小型高速離心機(jī) ( 美國(guó) Thermo 公司) ，超聲清洗儀( 昆山市超聲儀 器有限公司) ，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器( 海林市其林貝爾儀器 制造有限公司) ，渦旋振蕩器( 海林市其林貝爾儀器制造有限公司) ，Q Exactive 質(zhì)譜儀( 美國(guó) Thermo Fisher 公司) ，電子天平( 梅特勒 托利多儀器 ( 上海) 有限公司) ，金屬浴( 杭州博日科技有限公 司) ，電泳設(shè)備( 美國(guó) Bio-Ｒad( 伯樂(lè)) 公司) 。 MM. 1S 細(xì)胞( 美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)，American type culture collection，ATCC ) ，ＲPMI1640 培養(yǎng)基( 通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部，GE Healthcare Life Science) ，胎牛血清( 浙江天杭生 物科技有限公司) ，NP-40 裂解液( NP-40 LysisBuffer，上海阿拉丁生化科技股份有限公司) ，環(huán) 氧基磁珠( 日本 Tamagawa Seiki 公司，TAS8848 N1110) ，奈非那韋( 美國(guó) Med Chem Express LLC 公司) ，銀染試劑盒( 北京索萊寶科技有限公司) ， DMF ( N，N-dimethylformamide，N，N 二甲基甲酰 胺，上海阿拉丁生化科技股份有限公司) ，無(wú)水碳 酸鉀( 成都市科隆化學(xué)品有限公司) ，胰蛋白酶 ( 普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司) 。 

2 方法

 2. 1 細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白質(zhì)提取

 使用含胎牛血清體積分?jǐn)?shù)為 10% 的胎牛血 清( fetal bovine serum，F(xiàn)BS) 的 ＲPMI-1640 培養(yǎng) 基，將 MM. 1S 細(xì)胞培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)為 5% 的 CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱( 37 ℃ ) 。待其長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取 4 × 107 個(gè) MM. 1S 細(xì) 胞，加 NP-40 裂 解 液 裂 解 20 min，以離心力 12 000 × g 離心 15 min，留取上 清溶液，得到蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物，參考已報(bào)道的研究方法，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 

2. 2 環(huán)氧基磁珠與奈非那韋偶聯(lián)

 利用 DMF 溶解奈非那韋，與環(huán)氧基磁珠混 合，加入無(wú)水碳酸鉀( 作為催化劑，促進(jìn)環(huán)氧基磁 珠和奈非那韋的羥基基團(tuán)反應(yīng)，形成化學(xué)鍵) ，奈 非那韋終濃度分別為 0、2、10、50 mmol·L － 1 ，在金 屬浴中充分反應(yīng) 20 h( 60 ℃ ) ，使奈非那韋與帶有 環(huán)氧基端的磁珠偶聯(lián)，成為結(jié)合緊密的磁珠 配基 化合物。 

2. 3 捕獲奈非那韋作用蛋白

 將“2. 2 ”條 中 磁 珠 奈 非 那 韋 偶 聯(lián) 物 和 MM. 1S 細(xì)胞蛋白裂解物共孵育。在 旋 轉(zhuǎn) 器 上 ( 4 ℃ ) 孵育4 h。利用磁珠分離器分離磁珠，加入 100 mmol·L － 1 氯化鉀緩沖液清洗 3 次，最后用 1 × SDS-PAGE上樣緩沖液解離結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)。

 2. 4 SDS-PAGE 電泳與銀染鑒定

 將“2. 3”條中解離的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行 SDSPAGE 電泳( 恒電流30 mA) 。電泳結(jié)束后，對(duì) PAGE 膠進(jìn)行銀染分析: 先在固定液中固定30 min，然后加 入敏化液，室溫條件下作用 30 min; 再將敏化的 PAGE 膠浸沒(méi)在銀染液中，室溫震蕩搖晃 40 min， 確保 其 充 分 染 色。最后在顯色液 中顯色約 10 min，加入終止液，觀察條帶的分布情況。

 2. 5 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定 

取 0 mmol·L － 1 ( 空白磁珠結(jié)合蛋白) 和 50 mmol·L － 1 ( 50 mmol·L － 1 奈非那韋結(jié)合蛋白)的 PAGE 膠條，經(jīng)過(guò)還原和烷基化處理后，加入胰 蛋白酶酶解 20 h( 37 ℃) 。酶解后用 C18柱子除鹽， 除鹽多肽凍干后用 Loading buffer( 含甲酸、乙腈) 溶解后，使用質(zhì)譜儀對(duì)酶解后樣品進(jìn)行鑒定，最后 采用 MASCOT 等質(zhì)譜匹配軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， 獲得環(huán)氧基磁珠偶聯(lián)蛋白質(zhì)的定性鑒定信息。

 2. 6 生物信息學(xué)分析

 通過(guò) GO 數(shù)據(jù)庫(kù)和 KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)奈非那 韋作用蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析: 采用 GO 功能 注釋，從生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞定位和分子功能 3 個(gè)方面，描述奈非那韋作用蛋白可能行使的分子 功能、細(xì)胞定位和參與的生物學(xué)過(guò)程。再將奈非 那韋作用蛋白代入 KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)，研究其可 能參與的代謝通路以及相關(guān)疾病信息。

3 結(jié)果

SDS-PAGE 電泳后，將 PAGE 膠進(jìn)行銀染分 析，如圖1所示，相較于前3條泳道( 空白磁珠結(jié)合蛋白、2 mmol·L － 1 奈非那韋偶聯(lián)磁珠結(jié)合蛋 白、10 mmol·L － 1 奈非那韋偶聯(lián)磁珠結(jié)合蛋白) ， 第 4 泳道( 50 mmol·L － 1 奈非那韋偶聯(lián)磁珠結(jié)合 蛋白) 可見(jiàn)明顯蛋白條帶。上述結(jié)果說(shuō)明利用環(huán) 氧基磁珠偶聯(lián)奈非那韋，能捕獲該化合物特異作 用蛋白，提高了蛋白鑒定結(jié)果和生物信息學(xué)分析 的可信度。相比空白磁珠，奈非那韋捕獲的蛋白 更具有多樣性和特異性，同時(shí)提示: 后續(xù)蛋白質(zhì)譜 鑒定分析應(yīng)將空白磁珠測(cè)定數(shù)據(jù)作為本底予以 扣除。

4 討論 

采用磁珠分離法捕獲奈非那 韋作用蛋白，相對(duì)于其他捕獲靶蛋白的方法，此方 法更簡(jiǎn)單、高效、易于自動(dòng)化。通過(guò)磁珠與藥物某 個(gè)特定基團(tuán)反應(yīng)，將藥物與磁珠偶聯(lián)，再與蛋白孵 育，捕獲藥物作用的靶蛋白。由于奈非那韋已在 MM 治療中突顯前景，本研究中，作者利用質(zhì)譜技 術(shù)將環(huán)氧基磁珠 奈非那韋結(jié)合物捕獲的蛋白 ( 來(lái)源于 MM. 1S 細(xì)胞) 進(jìn)行蛋白鑒定，根據(jù)可信 度篩選出 3 個(gè)與腫瘤活性相關(guān)的蛋白: L 乳酸脫 氫酶、ＲPS3 和 VDAC1。L 乳酸脫氫酶會(huì)促進(jìn)癌 細(xì)胞的糖酵解過(guò)程，使葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸鹽，為腫 瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖提供能量，血清中 L 乳酸脫氫 酶水平可以作為預(yù)測(cè)晚期癌癥患者生存時(shí)間的有 效指標(biāo); 研究結(jié)果顯示，ＲPS3 蛋白是惡性腫瘤 的指標(biāo)，是重要的促腫瘤發(fā)生因子; 含量較高 的 VDAC1 作為代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)體參與了癌細(xì)胞的代 謝，其表達(dá)與癌細(xì)胞侵襲相關(guān)。據(jù)此推斷 L 乳酸脫氫酶、ＲPS3 和 VDAC1 可能與奈非那韋抗 MM 作用有關(guān)，為確定奈非那韋抗 MM 作用機(jī)制 提供理論依據(jù)。

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