帕金森病模型大鼠腦黑質(zhì)影響分析（SHZ-88使用）

帕金森病( Parkinson’s disease，PD) 是一種常見于中老 年人的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其主要有兩大病理特征，其一是 以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元及其他含色素的神經(jīng)元大量變性丟 失，尤其是黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺能神經(jīng)元丟失最嚴重; 其二是 在殘存的神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體，即路易小體 ( Lewy body) 。目前 PD 的確切病因和發(fā)病機制仍未完全明 了，認為是多因素交叉作用下發(fā)病，遺傳易感性增加患病幾 率，在環(huán)境因素、神經(jīng)系統(tǒng)老化等因素共同作用下，通過氧 化應激、線粒體功能紊亂、蛋白酶體功能障礙、炎癥和( 或) 免疫反應、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、興奮性毒性、細胞凋亡等機制導致 黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元大量變性、丟失，才會發(fā)病。近年 來發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激( EＲS) 介導的凋亡在 PD 的發(fā)病機制中 有重大作用。

1 材料與方法

1． 1 實驗材料

1． 1． 1 實驗動物

實驗動物為 SPF 級雄性 SD 大鼠，體質(zhì) 量 200 ～ 250 g 之間，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供， 實驗動物許可證編號: SCXX( 遼) 2015 － 0001。大鼠飼養(yǎng)于 遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心，使用許可證號: SYXK( 遼) 2013 － 0009。飼養(yǎng)溫度 18 ～ 22 ℃，相對濕度: 40% ～ 70% 。

1． 1． 2 實驗藥品

獨活飲片、獨活顆粒劑、獨活復方顆粒 劑、塞來昔布膠囊、美多芭片購自遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 藥局，獨活香豆素由沈陽藥科大學提取，獨活復方源自唐代 孫思邈《備急千金藥方·風懿》獨活湯。

1． 1． 3 實驗試劑

Lactacystin、阿撲嗎啡，購自美國 Sigma 公司; TriZol( 批號 14105) ，購自 Invirogen 公司; 逆轉(zhuǎn)錄試劑 盒( 批號 0051509) ，購自 New England Biolabs; 擴增試劑盒 ( 批號 0006231745) ，購自 Agilent; 蛋白質(zhì)裂解液、一抗稀釋 液、ECL 化學發(fā)光試劑，購自碧云天生物技術(shù)研究所; 蛋白 測定試劑盒，購自鼎國生物技術(shù)有限公司; 兔抗人 β － Actin 多克隆抗體，購自 Santa Cruz; 羊抗兔 HＲP － IgG，購自 Santa Cruz; anti － CHOP、anti － Caspase12，購自 cell signal 公司。

1． 1． 4 儀器設備

全自動腦立體定位儀，德國 Neurostar stereodrive 生產(chǎn); 多功能酶標儀( TriStar2 LB 942 型) ，德國 伯托生產(chǎn); 水浴恒溫振蕩器( 其林貝爾SHZ-88 型) ，其林貝爾公司 生產(chǎn); 臺式多功能冷凍高速離心機，德國賽默飛生產(chǎn); 垂直 板電泳裝置( Mini － Protean tetra 型) ，美國 Bio － Ｒad 公司 生產(chǎn); 半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀( Trans － Blot SD 型) ，美國 Bio － Ｒad 公 司生產(chǎn); 全自動熒光與可見光凝膠成像分析系統(tǒng)( F3 型) ， 英國 Syngene 公司生產(chǎn)。

1． 2 方法

1． 2． 1 模型制備及分組

采用腦黑質(zhì)致密部注射 Lactacystin 的方法復制 PD 大鼠模型。根據(jù)《大鼠 腦立體定位圖譜》，結(jié)合預實驗結(jié)果，模型復制大鼠定位 注射 10 μg Lactacystin( 2 μL) ，另設假手術(shù)組和正常對照 組，假手術(shù)組定位注射等體積生理鹽水，具體方法請參考。模型復制后觀察大鼠一般行為學改變，并于造模后 的第 7、14、21、28 天，進行阿撲嗎啡( APO) 檢測，觀察并記 錄大鼠旋轉(zhuǎn)方向及旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。于最后一次 APO 檢測后，根 據(jù)大鼠行為學異常程度，應用分層隨機法，將模型復制大鼠 分為 7 組: 模型對照組、吐溫 80 組、獨活香豆素組、獨活顆 粒劑組、獨活復方顆粒劑組、塞來昔布組、美多芭組。

1． 2． 2 藥物干預

各組大鼠給藥劑量按照人與大鼠劑量 換算公式進行計算，獨活香豆素、獨活顆粒劑及獨活復方顆 粒劑均以含生藥劑量為準，獨活香豆素、獨活顆粒劑依據(jù)前 期研究予常規(guī)劑量的 3 倍量。即獨活香豆素組: 3 g· kg － 1 ·d － 1 ; 獨活顆粒劑組: 3 g·kg － 1 ·d － 1 ; 獨活復方顆粒 劑組: 6． 3 g·kg － 1 ·d － 1 ; 塞萊昔布組: 20 mg·kg － 1 ·d － 1 ; 美多芭組: 25 mg·kg － 1 ·d － 1 ; 吐溫 80 組: 0． 08% 吐溫 801 mL·100 g － 1 ·d － 1 ; 正常對照組、模型對照組、假手術(shù)組: 等 體積生理鹽水。除獨活香豆素用 0． 08% 吐溫 80 助溶外， 其余藥物均用生理鹽水配制，體積相同。給藥時間上午 8 ∶ 00 － 10 ∶ 00，日 1 次灌胃。每周稱體質(zhì)量 1 次，根據(jù)大鼠體 質(zhì)量每周調(diào)整藥物劑量( 體積) ，連續(xù)給藥 10 周。

1． 2． 3 行為學檢測

給藥后觀察各組大鼠是否出現(xiàn)一般 行為學異常; 并于給藥后的第 14、28、42、56、70 天，進行 APO 檢測，觀察大鼠旋轉(zhuǎn)行為、旋轉(zhuǎn)方向及旋轉(zhuǎn)圈數(shù)并記 錄。

1． 2． 4 指標檢測

大鼠于最后一次 APO 檢測后的次日， 每組隨機選取 6 只大鼠，過度麻醉處死，斷頭，取左側(cè)腦黑 質(zhì)，分別采用 ＲT － PCＲ( 每組 3 例) 、Western － blot 法( 每組 3 例) ，對大鼠腦黑質(zhì) CHOP、Caspase12 mＲNA 和蛋白表達 水平進行檢測。 ( 1) ＲT － PCＲ 檢測: 采用實時熒光定量 PCＲ 法，對各 組大鼠腦黑質(zhì)中 CHOP、Caspase12 mＲNA 的表達水平進行 檢測。取新鮮的腦黑質(zhì)組織 100 mg，按照 TriZol 說明書提 取總 ＲNA。取 1μg 的總 ＲNA，用 ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。cDNA 稀釋 4 倍后，用于實時熒光定量 PCＲ 檢測。熒光定量 PCＲ 使用 Brilliant II SYBＲ Green QPCＲ Master Mix 試劑盒。PCＲ 反 應條件: 94 ℃，5 min; 40 × ( 94 ℃，20 s; 59 ℃，20 s; 72 ℃，30 s) 。引物序列見表 1，GAPDH 作為內(nèi)參對照，基因的相對 表達量用 2 － △△Ct 法計算。

( 2) Western － blot 檢測: 采用 western － blot 法檢測各組 大鼠腦黑質(zhì)組織中 CHOP、Caspase12 的表達水平。采用細 胞裂解液裂解法提取黑質(zhì)組織中總蛋白，并測定蛋白濃度， 加入上樣緩沖液煮沸變性后，以 50 μg /孔的總蛋白量進行 垂直電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜，封閉液封閉 1 h， 一抗( 1 ∶ 500) 4 ℃孵育過夜，洗膜后，二抗( 1 ∶ 1500) 室溫孵 育 2 h，洗膜后，將 PVDF 膜置于凝膠成像分析系統(tǒng)中，滴加 ECL 工作液，采集圖像，并測定目的蛋白及內(nèi)參蛋白條帶灰 度值，并以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為該 樣本中目的蛋白的相對表達水平，進行統(tǒng)計分析。

1． 2． 5 統(tǒng)計學方法

應用 SPSS 19． 0 統(tǒng)計分析軟件進行 數(shù)據(jù)分析處理。所有實驗數(shù)據(jù)均采用 x 珋± s 表示，組間比較 采用單因素方差分析，以P ＜ 0. 05 為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

模型復制后，大鼠逐漸出現(xiàn) 食欲下降，自主活動減少，隨著時間推移，多數(shù)大鼠相繼出 現(xiàn)運動遲緩、震顫、對外界刺激反應下降、不自主豎毛、尾僵 等行為學改變。給予干預因素后，獨活香豆素組、獨活顆粒 劑組、獨活復方顆粒劑組、塞來昔布組和美多芭組大鼠上述 癥狀均明顯改善; 模型對照組和吐溫 80 組大鼠癥狀無明顯 改善; 假手術(shù)組和正常對照組在干預前后如常，未發(fā)現(xiàn)其行為學異常。模型復制大鼠腹腔 注射 APO 后，多數(shù)大鼠出現(xiàn)不同程度的旋轉(zhuǎn)行為，表現(xiàn)為 身體彎曲，甚則首尾相接旋轉(zhuǎn)。分組予以藥物干預后，獨活 香豆素組、獨活顆粒劑組、獨活復方顆粒劑組、塞來昔布組、 美多芭組大鼠旋轉(zhuǎn)行為均較模型對照組和吐溫 80 組有明 顯改善，但以獨活香豆素組改善最明顯。

3 討論

獨活始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》被列為上品，并有“久服輕身耐老”的記載。如今的《中藥學》教材將獨活列為祛風 寒濕藥之首，辛、苦，微溫，歸腎、膀胱經(jīng)，具有祛風濕，止痛， 解表的功效。綜觀中醫(yī)歷代文獻記載，我們發(fā)現(xiàn)，獨活還具 有調(diào)補五臟，尤善補腎，祛瘀化痰，宣通腦絡之功，是一味入 陰而升陽，通補并用的良藥?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，獨活 中含有 29 種香豆素，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、鈣拮抗、調(diào)控凋 亡、抗自由基、抗心律失常、擴冠、降壓、抗血小板聚集和血 栓形成、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠、抗腫瘤、保肝、解痙、抗胃潰瘍等 作用。我們曾經(jīng)對獨活、獨活醇提物及獨活香豆素延緩模 型鼠腦老化、癡呆、阿爾茨海默病( AD) 的研究，發(fā)現(xiàn)獨活參 與了多種抗衰老機制的調(diào)節(jié)。近年來我們研究發(fā)現(xiàn)， 獨活香豆素能夠改善 PD 模型大鼠行為學異常，抗氧化應 激、增強抗氧化能力、減少興奮性氨基酸 Glu 的異常增多、 降低血清炎癥因子的含量，對抗 PD 損傷。目前的一 些研究顯示，獨活及其有效成分的作用已從傳統(tǒng)的對風寒 濕痹傳統(tǒng)疾病的治療，拓展到抗腫瘤、保肝、對抗心血管系 統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、骨性相關(guān)疾病及多發(fā)性硬化等疾病的治療。 然而關(guān)于獨活及其有效成分對 PD 的神經(jīng)保護作用與內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)應激( EＲS) 的關(guān)系研究尚未見到報道。



 

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