陰道分泌物微生物組學(xué)分析(其林貝爾QL901使用)

女性不孕不育、習(xí)慣性流產(chǎn)、早產(chǎn)、死 胎、宮頸炎和陰道炎等泌尿生殖系統(tǒng)疾病一直困擾著許多 患者，其 中 許 多 疾 病 病 因 不 明，致 病 機(jī) 制 不 清 楚。 女性陰道微生態(tài)體系是由陰道內(nèi)的微生物菌群、機(jī) 體的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能和解剖結(jié)構(gòu)共同組成。正常 女性陰道內(nèi)存在大量常居菌群和少量條件致病菌，當(dāng)菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)時(shí)，就會(huì)改變陰道內(nèi)的微生態(tài)平衡， 導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。

１ 對(duì)象與方法

１．１ 研究對(duì)象

經(jīng)深圳市第七人民醫(yī)院倫理委員會(huì) 通過和深圳市鹽田區(qū)衛(wèi)健委批準(zhǔn)２０１６０２０２立項(xiàng)，選 擇２０１７－２０１８年在深圳市第七人民醫(yī)院婦產(chǎn)科門診 產(chǎn)檢妊娠婦女２０名，深圳市福田區(qū)婦幼保健院婦保 科健康查體未婚無性生活女性２９名。４９名 研 究 對(duì) 象陰道分泌物常規(guī)檢查均正常。

１．２ 標(biāo)本采集

研究對(duì)象排空膀胱內(nèi)尿液后，嚴(yán)格 無菌操作 采 集 陰 道 內(nèi) 分 泌 物。所 有 樣 本 均 －２０ ℃ 保存。

１．３ 儀器設(shè)備及試劑

Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ儀器、５４２７Ｒ 型低溫離心機(jī)購于 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，ＱＬ９０１型漩渦振蕩器購于海門其林貝爾，ＤＮＡ 提取試劑盒購于中 山大學(xué) 達(dá) 安 基 因 有 限 公 司，ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２５００ 測 序儀 購 于 美 國 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 公 司，１６ＳｒＤＮＡ 基 因 和 ＩＴＳ序列試劑盒購于華大基因有限公司。

１．４ 樣本 ＤＮＡ 提取

標(biāo)本用１ｍＬ 生理鹽水充分 震蕩洗脫后１２０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，棄上清后在 沉淀物中加入 ＤＮＡ 提取液５０μＬ，然后１００℃裂解 １０ｍｉｎ，再１２０００ｒ／ｍｉｎ離心５ｍｉｎ，上清液中樣本 ＤＮＡ 模板保存－２０ ℃冰箱備用。

１．５ 文庫構(gòu)建及測序

設(shè)計(jì)合成含有測序接頭的雙 Ｉｎｄｅｘ融合引物 （Ｖ４區(qū)大約１２０ｂｐ，ＩＴＳ１區(qū)１３０～ １５０ ｂｐ。 Ｖ４ Ｆ： ＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ， Ｖ４Ｒ：ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ；ＩＴＳ１Ｆ： ＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ，ＩＴＳ１Ｒ：Ｇ－ ＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣ），以 檢 測 合 格 的 樣 本 ＤＮＡ 為模板，擴(kuò)增樣本１６ＳｒＤＮＡ 基因的 Ｖ４區(qū)和ＩＴＳ序列的ＩＴＳ１區(qū)域，磁珠篩選目的擴(kuò)增片段， 最后用 合 格 的 文 庫 進(jìn) 行 Ｃｌｕｓｔｅｒ制 備 和 Ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ 測序。用 下 機(jī) 得 到 的 數(shù) 據(jù) 進(jìn) 行 相 應(yīng) 的 生 物 信 息 學(xué) 分析。

１．６ 序列拼接及數(shù)據(jù)處理

Ｉｌｌｕｍｉｎａ平臺(tái)下機(jī)數(shù)據(jù) 經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，濾除低質(zhì)量的ｒｅａｄｓ，剩余高質(zhì)量的 Ｃｌｅａｎｄａｔａ方可用于后期分析；利用 Ｏｖｅｒｌａｐ關(guān)系， 使用 ＦＬＡＳＨ （ｖ１．２．１１）軟件將雙末端測序得到的 成對(duì)ｒｅａｄｓ組裝成一條序列，得 到 高 變 區(qū) 的 Ｔａｇｓ， 拼接條件為最小匹配長度１５ｂｐ和重疊 區(qū) 域 允 許 錯(cuò) 配率為１０％，去除沒有ｏｖｅｒｌａｐ關(guān)系的ｒｅａｄｓ；利用 ＵＳＥＡＲＣＨ （ｖ７．０．１０９０）軟件將拼 接 好 的 Ｔａｇｓ聚 類成 ＯＴＵ，其主要過程包括利用 ＵＰＡＲＳＥ 軟件在 ９７％的相似度下將 Ｔａｇｓ聚成 ＯＴＵ 的代表序列和利 用 ＵＣＨＩＭＥ （ｖ４．２．４０）軟件將 ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)生的嵌 合體從 ＯＴＵ 代表序列中去除；然后通過 ＲＤＰｃｌａｓ－ ｓｉｆｅｒ （ｖ２．２）軟 件 將 ＯＴＵ 代 表 序 列 與 ＧｒｅｅｎＧｅｎｅ 數(shù)據(jù)庫比對(duì)，對(duì) ＯＴＵ 進(jìn)行物種注釋；基于 ＯＴＵ 和 物種注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度分析以及組間物 種差異分析。

１．７ 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間顯著性差 異分析，使用 Ｒ軟件 （ｖ３．１．１）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。檢 驗(yàn)水準(zhǔn)α＝０．０５。

２ 結(jié) 果

４９份樣本物種注釋 １６ＳｒＤＮＡ 基因 ＯＴＵ 通 過與 ＧｒｅｅｎＧｅｎｅ 數(shù) 據(jù) 庫 比 對(duì) 分 析， 分 別 注 釋 出 １３個(gè)門、２２ 個(gè) 綱、３２ 個(gè) 目、２７ 個(gè) 科、３７ 個(gè) 屬 和 ２１個(gè)種水平物種 。ＩＴＳ序列 ＯＴＵ 通過 與 ＧｒｅｅｎＧｅｎｅ數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，分別注釋出１個(gè)門、 １個(gè)綱、１個(gè)目、１個(gè)科、１個(gè)屬和２個(gè)種水平物種。２．２ ２９份無性生活女性和２０份妊娠婦女樣本物種 注釋 １６ＳｒＤＮＡ 基 因 ＯＴＵ 通 過 與 ＧｒｅｅｎＧｅｎｅ數(shù) 據(jù)庫比對(duì)分析，２９份無性生活女性樣本在種水平共 注釋出１９個(gè) 物 種，２０份 妊 娠 婦 女 樣 本 在 種 水 平 共注釋出７個(gè)物種。ＩＴＳ序列 ＯＴＵ 通過 與 ＧｒｅｅｎＧｅｎｅ數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，無性生活女性樣本 和妊娠婦女樣本均注釋出白假絲酵母菌和近平滑假 絲酵母菌。

３ 討 論

陰道內(nèi)廣泛定植的微生 物稱為陰道微生物群，被公認(rèn)為參與保護(hù)宿主免受 各種細(xì)菌、真菌和病毒感染的重要屏障。健 康 人 群體內(nèi)的微生物菌群處于良好的動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)平衡 狀態(tài)被打破時(shí)就會(huì)誘發(fā)或?qū)е履承┘膊?。絕大多數(shù) 微生物群與宿主相互影響和相互制約，形成共生關(guān)系，極少數(shù)條件致病菌可引起慢性感染。女性陰道 內(nèi)存在多種微生物菌群，主要寄居于陰道四周的側(cè) 壁黏膜中，共同形成生物膜，對(duì)維持陰道微生態(tài)的 平衡和預(yù)防感染起到了重要作用。菌群失調(diào)能引 起細(xì)菌性陰道炎，增加早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。陰道炎 患 者 陰 道菌群分布既可表現(xiàn)為正常，也可表現(xiàn)為失調(diào)狀態(tài)， 其中混合性陰道炎最容易復(fù)發(fā)。不同年齡段，不同 季節(jié)患者陰道菌群分布不同。



 

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