分析荷瘤小鼠移植腫瘤生長的影響

癌癥是一類嚴(yán)重危害人體健康的疾病，運(yùn)動(dòng)對(duì) 癌癥發(fā)生發(fā)展的影響已有一些研究，如近年有基礎(chǔ) 研究指出運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以促使小鼠脾NK細(xì)胞向腫瘤 細(xì)胞浸潤，從而減緩腫瘤的發(fā)生發(fā)展，從一些臨床 研究來看，適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動(dòng)對(duì)于癌癥患者也有一定的積 極作用。但不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)腫瘤發(fā)展的影響研 究較少。本研究選擇有氧運(yùn)動(dòng)和力竭運(yùn)動(dòng)，探討運(yùn) 動(dòng)及運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)小鼠腫瘤生長的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

ICR 和 C57BL/6 小鼠，SPF 級(jí)體重 18—20g，雄 性，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物 合格證號(hào)SCXK(京)2016-0011。

1.2 瘤株

小鼠肝癌細(xì)胞 H22，小鼠黑色素瘤細(xì)胞 B16-F10，小鼠淋巴瘤細(xì)胞Yac-1。北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物部提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清，刀豆蛋白A(Con A)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)(美國 Sigma 公司)；二甲 基亞砜(DMSO)(北京化工廠)；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性 檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.4 儀器

Sartorious BT-25S型電子分析天平（北京Sartorius 儀器有限公司）；G&G JJ550 型精密電子天平 （美國雙杰兄弟有限公司）；1—14 高速臺(tái)式離心機(jī) （德國Sigma公司）；VD-1320潔凈工作臺(tái)（哈爾濱市 東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；超低溫冰箱（美國 Sanyo 公司）；TE2000-S 型倒置顯微鏡（日本 Nikon 公司）；MCO-18A/C(UV) CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公 司)；Spectra-Max-190 型酶標(biāo)儀(美國分子儀器公司)，MH-Ⅰ型微量振蕩器(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.5 小鼠分組與處理

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)兩天后，將小鼠隨機(jī)分為6組， 每組12只，分組如下： 正常對(duì)照組：本組小鼠均為未接瘤健康小鼠，自 由飲食，不做其他處理。 荷瘤對(duì)照組：本組小鼠均自由飲食，實(shí)驗(yàn)開始后 第7天接種腫瘤，不做其他處理。 持續(xù)有氧組：本組小鼠每天進(jìn)行游泳訓(xùn)練：取一 大小約為 60cm × 50cm × 50cm 水槽，加水至深度 40cm，水溫控制在（30±1）℃，將本組小鼠置于水槽 中游泳后撈出，時(shí)間從30min逐漸持續(xù)至60min，用 吹風(fēng)機(jī)吹干后放回籠中，每天一次，在實(shí)驗(yàn)開始后第 7天接種腫瘤。 持續(xù)力竭組：本組小鼠每天進(jìn)行負(fù)重游泳訓(xùn)練： 容器規(guī)格同上，負(fù)重為體重5%，材料為自制鐵絲圈， 固定于小鼠尾部，將本組小鼠置于水槽中，小鼠游泳 至力竭撈出，用吹風(fēng)機(jī)吹干后放回籠中，力竭判斷標(biāo)，即為小鼠游泳動(dòng)作明顯失調(diào)(劃水頻 率極其緩慢，連續(xù)下沉)，不能再堅(jiān)持，沉入水底連續(xù) 8s不能回到水面，撈出水面時(shí)翻正反射消失。本組 小鼠在實(shí)驗(yàn)開始后第7天接種腫瘤。 荷瘤后有氧組：本組小鼠在實(shí)驗(yàn)開始后第7天 接種腫瘤，其后每天進(jìn)行上述有氧游泳訓(xùn)練，每天一 次。 荷瘤后力竭組：本組小鼠在實(shí)驗(yàn)開始后第7天 接種腫瘤，其后每天進(jìn)行上述力竭游泳訓(xùn)練，每天一 次。

1.6 小鼠腫瘤接種

將H22瘤株經(jīng)ICR小鼠腹水 傳代后，無菌取小鼠腹水瘤，用 PBS 稀釋并調(diào)整細(xì) 胞密度為1×107 個(gè)/ml，接種于ICR小鼠前肢腋下，每 只 0.2ml；取對(duì)數(shù)生長期的 B16-F10 腫瘤細(xì)胞株，消 化后用PBS混懸并調(diào)整細(xì)胞密度為1×107 個(gè)/ml，接 種于C57BL/6小鼠前肢腋下，每只0.2ml，觀察并記 錄小鼠腫瘤生長情況。

1.7 小鼠體重、瘤重、脾臟重、胸腺重測定及脾臟指 數(shù)、胸腺指數(shù)計(jì)算

實(shí)驗(yàn)每天對(duì)小鼠進(jìn)行一般情況觀察，共持續(xù)21天，實(shí)驗(yàn)最后一天稱重后處死小 鼠，剝離小鼠腫瘤組織、脾臟和胸腺，精密稱定，計(jì)算 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)：胸腺指數(shù)=[胸腺質(zhì)量(mg)/體 重(g)]×10；脾臟指數(shù)=[脾臟質(zhì)量(mg)/體重(g)]×10。

1.8 脾淋巴細(xì)胞增殖

小鼠無菌取脾后，常規(guī)分離脾 細(xì)胞，細(xì)胞懸液調(diào)整密度為 5×106 /ml，加入 96 孔細(xì) 胞培養(yǎng)板，100μl/孔，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。將刀豆蛋白 conA 粉末用 PBS 溶液配成 5mg/ml 溶液，再用 1640 培養(yǎng)基最終稀釋成5μg/ml刀豆蛋白溶液，實(shí)驗(yàn)組加 入該溶液 100μl/孔，對(duì)照組加入 100μl/孔的 1640 培 養(yǎng)基。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育20h，1000r/min 離心 96 孔板 10min，棄上清，然后加入 0.5mg/ml 的 MTT 100μl/孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h， 再次以 1000r/min 離心 96 孔板 10min，棄上清，每孔 加入二甲基亞砜150μl，振蕩搖勻，30min后，用酶標(biāo) 儀測定(570nm)，脾淋巴細(xì)胞增殖能力計(jì)算：脾細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)組A(吸光度)值-對(duì)照組A(吸收度)值。

1.9 Yac-1細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測小鼠脾NK細(xì)胞殺傷能力

設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和小鼠淋巴瘤細(xì)胞Yac-1自然釋放 組，每組4個(gè)復(fù)孔，其中實(shí)驗(yàn)組將上述調(diào)整好的脾細(xì) 胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μl/孔，再將培養(yǎng)后 調(diào)整為1×105 /ml的Yac-1細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培 養(yǎng)板，100μl/孔；Yac-1細(xì)胞自然釋放組加入100μl的 Yac-1 細(xì)胞懸液，再加入 100μl 1640 培養(yǎng)基。置 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 4h，1000r/min 離心 96 孔 板10min，每孔吸出120μl上清至一新的96孔細(xì)胞培 養(yǎng)板相應(yīng)位置，各孔分別加入 60μl LDH 檢測工作 液，混勻，室溫(約25℃)避光孵育30min(可用鋁箔包 裹后置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng))，然后用 酶標(biāo)儀在490nm處測定吸光度值。脾NK細(xì)胞殺傷 活性計(jì)算：實(shí)驗(yàn)組A(吸光度)值-Yac-1自然釋放組A( 吸光度)值。

2 結(jié)果

ICR 小鼠荷瘤后有氧組瘤重減少 （與荷瘤對(duì)照組相比，P＜0.05），持續(xù)有氧組及荷瘤 后力竭組瘤重有一定下降趨勢，持續(xù)力竭組小鼠瘤重有一定增加趨勢，但與荷瘤對(duì)照組相比均無顯著 性差異。另外，ICR小鼠荷瘤對(duì)照組比正常對(duì)照組 和其他實(shí)驗(yàn)組體重均明顯升高（與正常對(duì)照組相比， P＜0.001）。C57BL/6 小鼠持續(xù)力竭組瘤重增 加（與荷瘤對(duì)照組相比，P＜0.05），其他荷瘤組瘤重 與荷瘤對(duì)照組相比沒有顯著性差異。持續(xù)力竭組小 鼠體重顯著高于荷瘤對(duì)照組（P＜0.01）及其他組小 鼠體重，可能與這組小鼠的瘤重較大有關(guān)。

3 討論

研究小鼠荷瘤前后運(yùn)動(dòng)及不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)小鼠 體重、瘤重、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖能 力、脾NK細(xì)胞殺傷能力等的影響發(fā)現(xiàn)，雖然荷不同 移植性腫瘤的不同品系小鼠對(duì)有氧和力竭兩種運(yùn)動(dòng) 強(qiáng)度迥異的游泳訓(xùn)練反應(yīng)有所不同，但總的趨勢相似：有氧運(yùn)動(dòng)可以抑制某些小鼠腫瘤生長而力竭運(yùn) 動(dòng)往往有利于某些腫瘤的生長；瘤重的變化與運(yùn)動(dòng) 強(qiáng)度對(duì)小鼠脾臟和胸腺功能的影響有關(guān)。



 

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