串聯質譜法測定蛋白胨中9種B族維生素

維生素是維持人和動物正常生理功能不可或缺 的一類微量有機物質，在人體生長、代謝、發(fā)育過程 中發(fā)揮著重要作用。人體必需維生素可分為兩類：水溶性維生素和脂溶性維生素，其中水溶性維生 素中又以 Ｂ 族維生素最為重要，Ｂ 族維生素主 要包括硫胺素（ＶＢ1）、核黃素（ＶＢ2）、煙酰胺、煙酸ＶＢ3）、泛酸（ＶＢ5）、吡哆素（ＶＢ6）、生物素（ＶＢ7）、 葉酸（ＶＢ9）和鈷胺素（ＶＢ12）等。蛋白胨是一種 利用蛋白質酶解得到的水溶性混合物。作為微生物 培養(yǎng)基的基礎成分，蛋白胨可以提供大部分微生物 生長、發(fā)育、繁衍所需要的營養(yǎng)氮源。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

Ｕｌｔｉｍａｔｅ 3000 超高效液相色譜儀、ＴＳＱ Ｅｎｄｕｒａ 三重四極桿質譜儀（美國 Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ 公司）；旋渦混合器VORTEX-5（海門市其林貝爾）；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 萬分之一電 子天平（北京賽多利斯公司）。 甲醇、甲酸銨均為色譜純（德國 ＣＮＷ 公司）；甲 酸為色譜純（天津市福晨化學試劑廠）。維生素 Ｂ2 （純度 98. 2％）、維生素 Ｂ6（純度 100. 0％）、維生素 Ｂ12（純度 90. 5％）、煙酸（純度 99. 8％）、煙酰胺（純 度 99. 9％）均購自中國食品藥品檢定研究院；維生 素 Ｂ1（純度 95. 2％）、泛酸（純度 96. 5％）、葉酸（純度 91. 3％）、生 物 素 （純 度 99. 0％）均 購 自 德 國 Ｄｒ． Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ公司。實驗用水由 Ｍｉｌｌｉ－Ｑ 系統(tǒng)（美國 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 公司）制得。 準確稱取適量標準品，維生素 Ｂ1、維生素 Ｂ2 和 生物素用甲酸溶解后用甲醇定容，其他標準品均用 甲醇溶解并定容，均置于 100 ｍＬ 棕色容量瓶中，配 制標準儲備液。移取各標準儲備液，用甲醇稀釋成 質量濃度為 50 ｍｇ ／ Ｌ 的混合標準中間液，于－18 ℃ 避光保存。根據需要用水逐級稀釋，配制成適當質 量濃度的混合標準溶液，現用現配。

1．2 樣品前處理

稱取 0. 2 ｇ（精確至 0. 000 1 ｇ）樣品，置于 50ｍＬ 離心管中，加入 10 ｍＬ 水，振蕩提取 10 ｍｉｎ，經 0. 22 μｍ 濾膜過濾后，供超高效液相色譜－串聯質譜 儀分析。以上操作均避光進行。

1．3 液相色譜與質譜條件

1．3．1 色譜條件

色譜柱：Ｓｙｎｃｒｏｎｉｓ Ｃ18 色譜柱（100 ｍｍ × 2. 1 ｍｍ，1. 7 μｍ，美國 Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ 公司）；柱溫：25 ℃；樣品室溫度：10 ℃；流速：0. 30 ｍＬ ／ ｍｉｎ；流動相 Ａ：0. 1％ （ｖ ／ ｖ）甲酸水溶液；流動相 Ｂ：0. 1％ （ｖ ／ ｖ） 甲酸甲醇溶液。梯度洗脫程序：0～2. 0 ｍｉｎ，90％ Ａ； 2. 0～3. 0 ｍｉｎ，90％ Ａ～ 45％ Ａ；3. 0 ～ 3. 5 ｍｉｎ，45％ Ａ～10％ Ａ；3. 5～4. 0 ｍｉｎ，10％ Ａ～ 90％ Ａ；4. 0 ～ 8. 0 ｍｉｎ，90％ Ａ。進樣量：2 μＬ。

1．3．2 質譜條件

離子源：ＥＳＩ 源；掃描方式：正離子掃描；檢測方 式：多反應監(jiān)測（ＭＲＭ）模式；離子源溫度：370 ℃； 離子傳輸管溫度：370 ℃；離子噴霧電壓：4 000 Ｖ； 鞘氣流速：1. 7 Ｌ ／ ｍｉｎ；輔助氣流速：0. 7 Ｌ ／ ｍｉｎ；碰撞 氣：氬氣。ＭＲＭ 監(jiān)測離子對、化合物保留時間和碰 撞能量（ＣＥ）等參數見表 1。


2 結果與討論

質譜應用技術中，流動相的選擇除考慮色譜的分離效果外還要考慮化合物的離子化程度，由于本 實驗選用電噴霧電離源、正離子模式，所以在流動相 中添加了甲酸。此外，有機相分別采用甲醇和乙腈 進行優(yōu)化，分析各種維生素的響應強度，最終采用甲 醇作為流動相中的有機相。為了確定本實驗的 ＭＲＭ 條件，依次將單一標 準品溶液（1. 0 ｍｇ ／ Ｌ）不經過色譜柱直接泵入質譜 中，在 ＥＳＩ－ 模式下，大部分維生素響應較低；在 ＥＳＩ＋ 模式下，9 種 Ｂ 族維生素均能獲得豐度較高的母離 子，其中鹽酸鹽、鈣鹽等都會脫去鹽后以單一分子的 狀態(tài)離子化，得到［Ｍ＋Ｈ］＋ 峰，維生素 Ｂ12則為多電 子物質，滿足［Ｍ＋Ｈ］＋ ／ ｎ 規(guī)律。確定母離子后，分 別對其子離子進行二級質譜掃描，選擇豐度較高、干 擾較小的兩對子離子作為定性離子，豐度最高的離 子作為定量離子，然后優(yōu)化其碰撞能量。用 0. 1％ （ｖ ／ ｖ）甲酸水溶液配制標準溶液，以各 Ｂ 族維生素的峰面積為縱坐標（ｙ）、質量濃度為橫 坐標（ｘ，μｇ ／ Ｌ）繪制標準曲線。結果表明，9 種維 生素均具有良好的線性關系，相關系數（Ｒ2 ）均大于 0. 999。以信噪比為 3 和 10 時的進樣濃度為最低檢 出含量和最低定量含量，根據樣品前處理過程，最終 計算得出該方法的檢出限為 0. 09～1. 67 μｇ ／ Ｌ。

3 結論

本實驗建立了同時測定蛋白胨中 9 種 Ｂ 族維 生素的超高效液相色譜－串聯質譜法，對比 Ｂ 族維生 素測定的相關國家標準，本方法不需要使用繁瑣的 微生物法或是高效液相色譜－熒光／ 紫外檢測法，簡 化了前處理步驟，降低了檢測成本，提高了檢測效 率。該法簡便、快速、準確、靈敏，經方法學驗證，所 建立方法具有良好的準確度、精密度與重復性，可為 蛋白胨中 Ｂ 族維生素種類和含量的測定提供技術 支持，并為蛋白胨質量提高及標準化生產提供參考。