真菌毒素的快速篩查和確證

真菌毒素（ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ）也叫霉菌毒素，是產(chǎn)毒 真菌在適宜環(huán)境條件下的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有生物 毒性。截至目前已分離得到 100 多種真菌，可產(chǎn)生 大約 300 種有毒的次級(jí)代謝產(chǎn)物。農(nóng)產(chǎn)品中常見 的真菌毒素有黃曲霉毒素（ａｆｌａｔｏｘｉｎ）、赭曲霉毒素 （ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ）、玉米赤霉烯酮（ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ）、伏馬 毒素（ｆｕｍｏｎｉｓｉｎ）、雜色曲霉素（ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｃｙｓｔｉｎ）、 單端孢霉烯族毒素（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）以及橘青霉素 （ｃｉｔｒｉｎｉｎ）等。糧谷類農(nóng)作物在種植過程中和貯藏 期間容易受到真菌的侵染，導(dǎo)致真菌毒素污染情況 普遍存在。由于近年來受全球氣候變暖、干旱等 因素的影響，世界各國真菌毒素暴露事件屢見不鮮， 特別是糧谷產(chǎn)品中多種真菌毒素混合污染現(xiàn)象頻頻發(fā)生，真菌毒素多殘留檢測(cè)受到越來越多的關(guān) 注和重視。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器、試劑與材料

四 極 桿／ 靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀 Ｑ－ Ｅｘａｃｔｉｖｅ、ＵｌｔｉＭａｔｅ 3000 高效液相色譜儀，Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ Ｃ18柱（100 ｍｍ×2. 1 ｍｍ，1. 9 μｍ） （美 國 Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 公 司）；Ｃａｐｔｉｖａ ＥＭＲ－Ｌｉｐｉｄ 凈 化 柱 （3 ｍＬ，美 國 Ａｇｉｌｅｎｔ 公 司）； 3Ｋ15 離心機(jī)（德國 Ｓｉｇｍａ 公司）；ＤＬ－5Ｃ 低速大容 量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；ＯＡ－ＳＹＳ 氮吹儀 （美國 Ｏｒｇａｎｏｍａｔｉｏｎ 公司）；Ｍｉｌｌｉ－Ｑ 超純水純化系統(tǒng) （美國 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 公司）；渦旋混合器（德國 ＩＫＡ 公司）。 黃曲霉毒素 Ｂ1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（ａｆｌａｔｏｘｉｎ－Ｂ1，質(zhì)量 濃度為 2. 0 ｍｇ ／ Ｌ）、黃 曲 霉 毒 素 Ｂ2 標(biāo) 準(zhǔn) 品 溶 液 （ａｆｌａｔｏｘｉｎ－Ｂ2，質(zhì)量濃度為 0. 5 ｍｇ ／ Ｌ）、黃曲霉毒素 Ｇ1 標(biāo) 準(zhǔn) 品 溶 液 （ａｆｌａｔｏｘｉｎ－Ｇ1，質(zhì) 量 濃 度 為 2. 0 ｍｇ ／ Ｌ）、黃曲霉毒素 Ｇ2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（ａｆｌａｔｏｘｉｎ－Ｇ2， 質(zhì)量濃度為 0. 5 ｍｇ ／ Ｌ）購自美國 Ｔｒｉｌｏｇｙ 公司；黃曲 霉毒素 Ｍ1（ａｆｌａｔｏｘｉｎ Ｍ1，純度為 99. 8％）、脫氧雪腐 鐮刀菌烯醇（ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ，純度為 99. 6％）、3－乙?；撗跹└牭毒┐?（3－ａｃｅｔｙｌ ｄｅｏｘｙｎｉ－ ｖａｌｅｎｏｌ，純度為 99. 0％）、15－乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌 烯醇（15－ａｃｅｔｙｌ ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ，純度為 99. 0％）、赭 曲霉毒素 Ａ（ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ－Ａ，純度為 99. 9％）、黃曲霉 毒素 Ｍ2（ａｆｌａｔｏｘｉｎ Ｍ2，純度為 99. 0％）、玉米赤霉烯 酮（ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ，純度為 99. 0％）、黃綠青霉素（ｃｉｔ－ ｒｅｏｖｉｒｉｄｉｎ，純 度 為 98. 0％）、蛇 形 菌 素 （ｄｉａｃｅｔｏｘｙ－ ｓｃｉｒｐｅｎｏｌ，純度為 98. 0％）、伏馬毒素 Ｂ1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 （ｆｕｍｏｎｉｓｉｎ Ｂ1，質(zhì)量濃度為 99. 7 ｍｇ ／ Ｌ）、伏馬毒素 Ｂ2 標(biāo) 準(zhǔn) 品 溶 液 （ｆｕｍｏｎｉｓｉｎ Ｂ2，質(zhì) 量 濃 度 為 100 ｍｇ ／ Ｌ）、伏馬毒素 Ｂ3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（ｆｕｍｏｎｉｓｉｎ Ｂ3，質(zhì) 量濃度為 100 ｍｇ ／ Ｌ）、ＨＴ－2 毒素（ＨＴ－2 ｔｏｘｉｎ，純度 為 99. 0％）、Ｔ－2 毒素（Ｔ－2 ｔｏｘｉｎ，純度為98. 0％）、雜色 曲霉素（ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｃｙｓｔｉｎ，純度為 99. 2％）均購自美 國 Ａｃｈｅｍｔｅｋ 公司，桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液（ｃｉｔｒｉｎｉｎ，質(zhì) 量濃度為 10 ｇ ／ Ｌ）購自以色列 Ｆｅｒｍｅｎｔｅｋ 公司。 乙腈和甲醇（色譜純，德國 Ｍｅｒｃｋ 公司）；甲酸 （色譜純，美國 Ｄｉｋｍａ 公司）；甲酸銨（色譜純，上海麥克林公司）；無水硫酸鎂和氯化鈉（優(yōu)級(jí)純，天津 科密歐公司）。

1．2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取 5. 00 ｇ 樣品于 50 ｍＬ 聚丙烯具塞離 心管中，加入 10 ｍＬ 水，渦旋混勻，再加入 10 ｍＬ 乙 腈（含 2％ 甲酸）、4 ｇ 硫酸鎂和 1. 5 ｇ 氯化鈉，振蕩提 取 10 ｍｉｎ，在 4 ℃條件下，以 5 000 ｒ ／ ｍｉｎ 的速度離 心 5 ｍｉｎ，移出 8 ｍＬ 上層乙腈相，加入 2 ｍＬ 水，渦 旋混合。取 3 ｍＬ 萃取液上樣到 Ｃａｐｔｉｖａ ＥＭＲ－Ｌｉｐｉｄ 凈化柱，使其在重力作用下流過凈化柱并收集凈化 液，待萃取液完全流過后，加壓排空凈化柱。取 2. 5 ｍＬ 凈 化 液 于 40 ℃ 水浴中氮吹至近干，用 5 ｍｍｏｌ ／ Ｌ 甲酸銨（含 0. 1％ 甲酸）－乙腈溶液（5 ∶ 5， ｖ ／ ｖ）定容至 1 ｍＬ，充分混勻后，過 0. 22 μｍ 有機(jī)相 濾膜，進(jìn)樣分析。

1．3 色譜－質(zhì)譜條件

Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄ Ｃ18 柱（100 ｍｍ × 2. 1 ｍｍ，1. 9 μｍ）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μＬ。流動(dòng) 相：Ａ 為 5 ｍｍｏｌ ／ Ｌ 甲酸銨水溶液，Ｂ 為乙腈－甲醇 （1 ∶1，ｖ ／ ｖ）；流速：0. 35 ｍＬ ／ ｍｉｎ。梯度洗脫條件：0 ～ 0. 8 ｍｉｎ，2％ Ｂ；0. 8～3. 0 ｍｉｎ，2％ ～24％ Ｂ；3. 0～ 4. 0 ｍｉｎ，24％ Ｂ；4. 0 ～ 6. 0 ｍｉｎ，24％ ～ 95％ Ｂ；6. 0 ～9. 0 ｍｉｎ，95％ Ｂ；9. 0 ～ 9. 5 ｍｉｎ，95％ Ｂ ～ 2％ Ｂ； 9. 5～12. 0 ｍｉｎ，2％ Ｂ。

2 結(jié)果與討論

因?yàn)楸狙芯克鶛z測(cè)的真菌毒素種類較多，需要 兼顧各類目標(biāo)待測(cè)物的提取效率。真菌毒素常用的 提取試劑有乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、正己 烷、二氯甲烷等，考察不同提取劑對(duì)目標(biāo)物的提取效 果，其中甲醇、乙腈對(duì)各種真菌毒素均有較好的提取 效率，優(yōu)于其他幾種提取劑。乙腈為極性較強(qiáng)的低 毒溶劑，具有優(yōu)良的溶解性，對(duì)大多數(shù)非極性和部分 極性真菌毒素有較高的提取率，并可促使蛋白質(zhì)變 性沉淀，提高提取效率，因此本研究選用乙腈（或 乙腈體系）作為提取劑。部分真菌毒素對(duì) ｐＨ、極性 范圍比較敏感，可在提取時(shí)加入輔助試劑增強(qiáng)聯(lián)合 提取效果，研究發(fā)現(xiàn)乙腈作為提取劑加入甲酸 可以提高伏馬毒素、赭曲霉毒素等的提取效果，經(jīng)過 實(shí)驗(yàn)優(yōu)化最終選擇乙腈（含 2％ 甲酸）作為提取液， 各種目標(biāo)待測(cè)物均取得了良好的提取效果。采用空白樣品基質(zhì)溶液準(zhǔn)確配制不同質(zhì)量濃度 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)高分辨質(zhì)譜檢測(cè)，以色譜峰面 積（Ｙ）為縱坐標(biāo)、對(duì)照溶液的質(zhì)量濃度（Ｘ，μｇ ／ Ｌ） 為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。高分辨質(zhì)譜使用目標(biāo)物的 精確質(zhì)量數(shù)提取，基線噪音很低，信噪比往往無窮 大，因此不采用以 3 倍信噪比（Ｓ ／ Ｎ）確定化合物檢 出限、10 倍信噪比確定化合物定量限（ＬＯＱ）的方 法，而是用向空白樣品中逐級(jí)降低加標(biāo)濃度，以各目 標(biāo)物在線性范圍中滿足回收率值在 60％ ～ 120％ 區(qū) 間內(nèi)的最低濃度為方法的定量限。結(jié)果表明，20 種 真菌毒素在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相 關(guān)系數(shù)（ｒ2 ）均＞0. 99，定量限為 0. 25 ～ 20 μｇ ／ ｋｇ，可 滿足檢測(cè)要求。

3 結(jié)論

利用高效液相色譜－四極桿／ 靜電場(chǎng)軌道 阱高分辨質(zhì)譜，快速篩查和確證了糧谷產(chǎn)品中 20 種 真菌毒素。高分辨質(zhì)譜保證了復(fù)雜樣品中基質(zhì)干擾 的消除，顯著提高了目標(biāo)物定性和定量結(jié)果的準(zhǔn)確 性。該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，可滿足糧谷產(chǎn)品中真 菌毒素的大通量快速篩查和確證。