注損傷模型大鼠的保護機制分析

0 引言

中國每年有200多萬人罹患腦血管疾病，而臨床上治 療腦缺血性疾病的唯一有效方法就是快速恢復(fù)腦組織的血 流使其再灌注。然而，在進行缺血在灌注的過程中，往 往會加重腦部的損傷，形成腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)。因此在對腦缺血進行 救治的過程中，除了迅速恢復(fù)腦組織的灌注外，亦需要對 后續(xù)的再灌注損傷進行防治。腦缺血再灌注損傷的病理生 理過程十分復(fù)雜，一般認為，隨氧化應(yīng)激反應(yīng)，細胞內(nèi)出 現(xiàn)了Ca2+超載，并進一步引發(fā)血管功能的缺失，最終引發(fā) 細胞凋亡。同時，越來越多的研究顯示，在腦缺血再灌 注損傷發(fā)病的過程中，細胞焦亡也發(fā)揮了重要的作用。細 胞焦亡是一種促炎性程序性細胞死亡，同細胞凋亡的程序 性主動死亡的不同，細胞焦亡誘發(fā)的細胞死亡效果更為 劇烈，其快速的形成質(zhì)膜孔洞，誘發(fā)細胞腫脹進而壞死、 并釋放細胞內(nèi)的內(nèi)容物和炎性遞質(zhì)。因此，細胞焦亡誘 發(fā)細胞死亡的過程更為直接，而對腦細胞帶來的損傷也更大。

1 材料和方法

1.1 設(shè)計

隨機對照動物觀察。

1.2 時間及地點

實驗于2017年12月至2019年4月在遼 寧中醫(yī)藥大學(xué)完成。

1.3 材料

1.3.1 實驗動物

健康雄性蒙古沙鼠80只，四五月齡，體 質(zhì)量50-70 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物學(xué)部提供。

1.3.2 藥品和試劑

腦心清膠囊(沈陽東新藥業(yè)有限公司， 批號：171002)；腦絡(luò)通膠囊(廣州市花城制藥廠，批號： 20171002)。Nissl試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒、乳酸 脫氫酶試劑盒、丙二醛試劑盒、谷胱甘肽試劑盒、一氧化 氮試劑盒、白細胞介素18和白細胞介素1β試劑盒均購自南 京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所。血小板內(nèi)皮細胞黏附因子1、 內(nèi)皮型一氧化氮合酶和磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶抗體購 自Abcam公司，ASC、NLRP3和Caspase-1抗體購自Sigma 公司。

1.3.3 主要儀器

水迷宮(成都泰盟科技有限公司)，酶標 儀(Thermo公司)，電泳儀及相關(guān)設(shè)備(Bio-Rad公司)，冰凍 切片機(Leica公司)，倒置顯微鏡(Nikon公司)，低溫高速離 心機(Eppendorf公司)，超純水裝置(法國Millipore公司)， 核酸蛋白定量儀(瑞士Amersshams公司)，精密天平(瑞士 Mettler公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組和給藥方法

將80只雄性蒙古沙鼠隨機 分為假手術(shù)組、模型組、腦心清組及腦絡(luò)通組。術(shù)后次日 開始假手術(shù)組正常飼養(yǎng)，模型組灌服同體積的生理鹽水， 腦心清組按照100 mg/(kg•d)灌胃給藥，腦絡(luò)通組按照 100 mg/(kg•d)灌胃給藥，連續(xù)給藥21 d。其中，在實驗結(jié) 束前1周進行水迷宮實驗，包括4 d的隱蔽平臺實驗和1 d的 空間探索實驗。而Nissl染色、免疫熒光實驗以及各marker 檢測，則在實驗結(jié)束麻醉下處死沙鼠后進行。

1.4.2 建立腦缺血再灌注損傷模型

隨機選取健康蒙古沙鼠，戊巴比妥鈉腹腔注射(40 mg/kg)麻醉后，用無創(chuàng)微 動脈夾同時夾閉雙側(cè)頸總動脈5 min，然后松開動脈夾，重 新恢復(fù)血流進行再灌注，制成沙鼠腦缺血再灌注損傷模型， 縫合皮膚。假手術(shù)組不夾閉雙側(cè)頸總動脈，其他手術(shù)操作 與模型組相同。

1.4.3 水迷宮實驗

水迷宮直徑200 cm，水深30 cm，水 溫(20±3) ℃，將水面平均分為4個象限。每只沙鼠每日訓(xùn) 練2次，60 s/次，共計3 d。第4天開始進行定位航行實驗， 平臺放置在任意象限，且位于水下1.5 cm，選取平臺鄰象 限和對象限作為入水點，記錄沙鼠在60 s內(nèi)尋找到平臺的 時間，空間探索實驗記錄動物通過平臺所在象限的次數(shù)。

1.4.4 Nissl染色

實驗結(jié)束，每組隨機選取6只沙鼠(剩余 沙鼠用于氧化應(yīng)激指標檢測和Western blot實驗)麻醉后處 死，取腦組織制備切片，每只取3張腦片，滴加Nissl染色 液，室溫孵育10 min。PBST洗3次，每次5 min，中性樹脂 封固，鏡下觀察。

1.4.5 免疫熒光實驗

沙鼠腦組織冰凍切片，PBS洗片3 次，每次5 min；冰上操作，0.2%Tritonx-100致孔15 min， PBS洗片3次，每次5 min。山羊血清封閉60 min后直接滴 加血小板內(nèi)皮細胞黏附分子1一抗(1∶200)，4 ℃條件下孵 育24 h，PBS洗片3次，每次5 min，避光條件下，滴加熒 光二抗(1∶100)室溫孵育30 min，PBS洗片3次，每次5 min； 滴加DAPI染核5 min，PBS洗片3次，每次洗5 min。甘油封固，熒光顯微鏡下觀察。將待測試管以快速振蕩器（海門市其林貝爾恒溫微孔板快速振蕩器QB-9006）混勻后，以保鮮膜扎緊試管 口，并刺破小孔。95 ℃沸水浴40 min后，取出冷卻，再 3 500-4 000 r/min，離心10min。取上清液在532 nm處， 以雙蒸水為對照，測定各管的吸光度。

2 結(jié)果

實驗選用沙鼠80只，分成4組， 實驗過程有脫失，進入結(jié)果分析至少14只。水迷宮定位航行實驗結(jié)果顯示，模型組沙鼠的逃 避潛伏期與假手術(shù)組相比明顯延長(P < 0.01)；腦心清組和 腦絡(luò)通組沙鼠的逃避潛伏期與模型組相比明顯縮短(P < 0.01)?？臻g探索實驗結(jié)果顯示，模型組沙鼠在目標象限的 游泳時間、有效停留時間及穿梭次數(shù)明顯減少(P < 0.01)； 與模型組相比，腦心清組和腦絡(luò)通組沙鼠在目標象限的游泳 時間、有效停留時間及穿梭次數(shù)明顯增加(P < 0.01)。Nissl染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組沙鼠的海馬CA1區(qū)錐體 細胞排列整齊、緊密，細胞結(jié)構(gòu)清晰完整，細胞核正常， 染色質(zhì)分布均勻，胞漿內(nèi)尼氏小體豐富。模型組沙鼠的海 馬CA1區(qū)可見部分神經(jīng)元丟失，排列不整齊，細胞輪廓模 糊，結(jié)構(gòu)不清，部分神經(jīng)元胞體皺縮，核固縮，胞漿深染， 胞漿內(nèi)尼氏小體減小。與模型組相比，腦心清組及腦絡(luò)通 組神經(jīng)元顯著增多，且排列較為整齊，細胞輪廓清晰，結(jié) 構(gòu)完整，神經(jīng)元胞體舒展，胞漿內(nèi)尼氏小體增大。通 過試劑盒檢測沙鼠海馬組織白細胞介素18和白細胞介素 1β的水平，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組沙鼠的白 細胞介素18和白細胞介素1β質(zhì)量濃度明顯升高(P < 0.01)； 與模型組相比，腦心清組及腦絡(luò)通組沙鼠的白細胞介素18 和白細胞介素1β質(zhì)量濃度明顯降低(P < 0.01)。

3 討論

腦組織的血流供應(yīng)中斷可引起一系列缺血級聯(lián)反應(yīng)， 而隨治療恢復(fù)供血后，腦部又會產(chǎn)生腦缺血再灌注損傷。 由于腦缺血再灌注損傷會改變腦血管的形態(tài)及功能，進而 降低腦部的物質(zhì)交換能力，隨供血供氧減少，誘發(fā)后續(xù)的 氧化及炎癥反應(yīng)，最終損傷腦細胞。由腦缺血再灌注損 傷的發(fā)生機制可知，該過程是一個多通路多靶點的協(xié)同過 程。而在治療的過程中，最有效的辦法的則是對腦缺血再 灌注損傷發(fā)病所對應(yīng)的相關(guān)通路全部進行抑制或阻斷，而 根據(jù)此次研究的結(jié)果可以看出，腦心清膠囊可以從多個角 度緩解腦缺血再灌注損傷的癥狀。