淺談皮細(xì)胞損傷的作用機(jī)制分析

脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種 成分，細(xì)菌裂解后進(jìn)入宿主體內(nèi)，能引起內(nèi)毒素血 癥，刺激機(jī)體炎癥因子的產(chǎn)生增加，產(chǎn)生局部或系 統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。大鼠腸隱窩上皮細(xì)胞（intestial epithelial cell line，IEC-6），為腸黏膜屏障的組成部 分，LPS 可誘導(dǎo) IEC-6 細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，炎癥介 質(zhì)引起緊密連接（TJ）復(fù)合物結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架和細(xì)胞通 透性的改變，這種炎癥反應(yīng)的發(fā)生將損害腸黏膜的 屏障功能 。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SD 大鼠（230~270 g），SPF 級(jí)，雄性，購 于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)： SCXK（湘）2016-0002。

1.2 細(xì)胞株

IEC-6 細(xì)胞，購于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

1.3 藥物及試劑

參苓白術(shù)散，北京漢典制藥有限公 司，批號(hào)：Z20040146；脂多糖（LPS），美國(guó) Sigma 公司產(chǎn)品，批號(hào)：025M4040V；TRIzol Reagent，北 京全式金公司，批號(hào)：K10526；MTT 細(xì)胞增殖試劑 盒，南京凱基生物有限公司，批號(hào)：20161229；IL8 ELISA 試劑盒，欣博盛生物科技有限公司，批號(hào)： ERC008；mcherry-GFP-LC3 雙標(biāo)腺病毒，漢恒生物 科技（上海）有限公司，批號(hào)：AP07071804；兩步 RT-PCR 試劑盒（批號(hào)：AE301）、100bp Plus DNA Ladder（批號(hào)：K20415），北京全式金公司；瓊脂糖 （Agarose）， Genview 公 司 ， 批 號(hào) ： 2B180205600； GoldView I 型核酸染料（批號(hào)：41230）、50×TAE 電泳液（批號(hào)：20141021），北京索萊寶公司； GAPDH、 ATG5、 ATG12、 ATG13、 ATG1611、 ATG1612 引 物，生工生物工程（上海）有限公司。

1.4 儀器

I 類 B 型醫(yī)用超凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；MCO175 型細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本 SANYO 公司；S40-SLIDER 倒置普通光學(xué)顯微鏡、 DMI3000B 型熒光倒置顯微鏡，德國(guó) Leica 公司； Elx800 型酶標(biāo)儀，美國(guó) BioTek 公司；PCR 儀，德國(guó) Eppendorf 公司。

2 結(jié)果

當(dāng) LPS 濃度達(dá)到 100 μg · mL-1 時(shí)，細(xì)胞活力值 與空白組比較開始出現(xiàn)明顯差異（P < 0.05），該濃度 下細(xì)胞抑制率為 29.3 %，因此選用 100 μg · mL-1 的 LPS 濃度為后期 IEC-6 細(xì)胞炎癥模型的造模濃度。與對(duì)照組比較，不 同濃度含量的參苓白術(shù)散含藥血清對(duì) IEC-6 細(xì)胞活 力均無明顯作用（P > 0.05）。mRFP -GFP -LC3 腺病毒滴 度為 1010 pf μ·mL-1 。從圖 4 可以看出，加入濃度梯 度為每孔 0.1、0.2、0.4、0.8 μL 的 mcherry- GFPLC3 腺病毒轉(zhuǎn)染 IEC-6 細(xì)胞，腺病毒轉(zhuǎn)染率和熒光 強(qiáng)度隨腺病毒濃度的加大而增強(qiáng)。每孔加入 0.4 μL 腺病毒時(shí) IEC-6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染率高，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，且 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)較 0.8 μL 腺病毒組正常，故 選取每孔加入 0.4 μL mRFP-GFP-LC3 腺病毒量作為 感染 IEC-6 細(xì)胞正式實(shí)驗(yàn)的濃度。與空白組比 較，模型組中自噬體斑點(diǎn)形成明顯減少或消失（P < 0.05）；與模型組比較，參苓白術(shù)散含藥血清組、自 噬誘導(dǎo)劑 Rapamycin 組的自噬斑點(diǎn)形成明顯增加，自 噬活力增強(qiáng)（P < 0.05）；自噬抑制劑 3-MA 組與模型 組比沒有差別，自噬斑點(diǎn)稀少（P < 0.05）。結(jié)果表明 參苓白術(shù)散能促進(jìn)損傷的 IEC-6 細(xì)胞發(fā)生自噬。

3 討論

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種以細(xì)胞質(zhì)空泡自噬化為特征的溶酶體依賴性降解途徑，實(shí)現(xiàn)細(xì) 胞本身代謝需要和某些細(xì)胞器更新，主要與細(xì)胞的 存活、分化、發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持密切相關(guān)， 在維持腸黏膜免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，細(xì)胞 自噬同樣發(fā)揮著重要作用。近期研究也證實(shí)在腸上 皮細(xì)胞中，自噬基因 ATG16L1 可負(fù)性調(diào)控 IL-1β 誘 導(dǎo)的炎癥因子表達(dá) ，任彩瑗等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬可通 過調(diào)控 NF-κB 分子信號(hào)通路抑制 LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。