其林貝爾靜音混合器對(duì)樺褐孔菌多糖的提取工藝

非酒精性脂肪肝病 ( nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD) 的主要特征是肝細(xì)胞內(nèi)脂肪的變性以及脂質(zhì)的貯 積，但同時(shí)無過量飲酒史的臨床病理綜合征。經(jīng)常伴有中 心性的肥胖、高血脂癥，對(duì)胰島素的抵抗能以力及對(duì)糖的耐量 異常等方面代謝綜合征，嚴(yán)重危害人類的健康。近年來， 對(duì) NAFLD 的研究很多，但對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究尚不清楚。因 此，尋找到有效治療 NAFLD 的藥物非常重要。

樺褐孔菌( Phaeoporus obliquus J． Schroet) ，別稱白樺茸， 被贊譽(yù)為“西伯利亞靈芝”，為真菌門擔(dān)子菌亞門層菌綱非褐 菌目多孔菌科褐臥孔菌屬，是一種非常珍稀而名貴的藥用真 菌，生長(zhǎng)在溫度相對(duì)較低的俄羅斯西伯利亞地區(qū)的原始森林 中，不能人工栽培，非常稀少，顏色呈深栗色，常在樹皮破損及 傷節(jié)處形成肉瘤狀菌核，菌塊性狀為近球形或不定形塊狀; 研 究發(fā)現(xiàn)，其化學(xué)成分包含多糖類化合物、芳香物質(zhì)、多酚類化 合物、三萜類化合物等物質(zhì)，具有重要的藥用價(jià)值。從 16 世紀(jì)至今，樺褐孔菌一直被作為一種民間藥物來治療糖尿 病、高血壓、抗衰老等，具有顯著的效果。對(duì)于非酒精性脂肪肝病的治療，目前還尚未見相關(guān)的研究報(bào)道。本試驗(yàn)通 過模擬臨床上 NAFLD 的病理特點(diǎn)，通過優(yōu)化提取樺褐孔菌多 糖提取物，將其作用于 HepG2 細(xì)胞，從細(xì)胞水平上來評(píng)價(jià)樺 褐孔菌多糖提取物對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)堆積的影響，以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)甘 油三脂含量的影響，從而揭示其在防治非酒精性脂肪肝方面 的藥用價(jià)值。

樺褐孔菌購(gòu)于黑龍江省綏芬河市; MTT、TG 試劑盒、油 酸、油紅 O 和細(xì)胞裂解液購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司; DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、血清、胰蛋白酶等細(xì)胞試劑購(gòu)于 Hylone 公司; 乙醇、異丙醇購(gòu)于北京化工廠; HepG2 細(xì)胞筆者所在實(shí) 驗(yàn)室傳代保存，由哈爾濱工業(yè)大學(xué)贈(zèng)送; 粉碎機(jī)( 戴聲設(shè)備有 限公司) 、超聲波清洗機(jī)( 杭州法蘭特超聲波科技有限公司， 總功 率 800 W) 、電 子 天 平 ( QUINTIX224 － 1CN Sartorius， Ｒ210) 、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀( 瑞士 BUCHI) 、電子顯微成像系統(tǒng)( CX31 Olympus) 、酶標(biāo)儀( Synergy HTX BioTek) 、靜音混合器( MT － 360 其林貝爾) 。

將樺褐孔菌粉末過篩，準(zhǔn)確稱取 5 g 溶于醇濃度為 30% 的乙醇中，在一定時(shí)間、溫度、料液比和超聲波功率下振蕩處 理一定 時(shí) 間，用 80% 乙醇沉淀多糖后，4 000 r /min，離 心 7 min 后取上清液，減壓濃縮至浸膏后水浴至干，得粗制多糖，標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定其含量。

設(shè)計(jì)樺褐孔菌多糖提取物單因素試驗(yàn)的變量條件分別為: 提取 溫度，20、30、40、50、80 ℃ ; 提取時(shí)間，10、20、30、40、50 min; 料 液比 1 g ∶ 8 mL、1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 15 mL、1 g ∶ 20 mL、 1 g ∶ 25 mL; 超聲功率，160、320、400、480、640 W，從而來確定 正交試驗(yàn)中各因素的水平。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用 正交試驗(yàn)表 L9 ( 34 ) 進(jìn)行正交試驗(yàn)，各因素與水平見表 1。

1． 3 細(xì)胞培養(yǎng)及 MTT 法測(cè)

HepG2 細(xì)胞活性 復(fù)蘇 HepG2 細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)室凍存的 HepG2 細(xì)胞從液氮罐 中取出，迅 速 放 于 37 ℃ 水 浴 鍋 中 融 化，用 PBS 清 洗 后， 1 000 r /min 離心去上清后將其放于含 10% FBS 的 DMEM 培 養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件: 溫度為 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為 5% 的 CO2、飽和 濕度，將培養(yǎng)好的 HepG2 細(xì)胞每隔 1 d 進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并將取 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞轉(zhuǎn)于 10% FBS 的高糖型 DMEM 培養(yǎng) 基進(jìn)行下一步試驗(yàn)。 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HepG2 細(xì)胞接種于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng) 板中，并利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板記數(shù)使每孔細(xì)胞的接種量達(dá)到 104 個(gè)，置于 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為 5% 的 CO2 培養(yǎng)箱中孵育 24 h 后， 設(shè)對(duì)照組和給藥組( 樺褐孔菌多糖提取物) ，給藥組的終濃度 分別為 6、60、600、6 000、60 000 mg / L，每組設(shè)置 3 個(gè)平行孔， 培養(yǎng) 24 h; 每孔加入 5 mg /mL MTT 溶液 10 μL，繼續(xù)在 37 ℃、 體積分?jǐn)?shù)為 5% 的 CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 h; 取出，緩慢吸去培 養(yǎng)液，然后每孔加入 100 μL 的 DMSO，振蕩 5 ～ 10 min; 酶標(biāo) 儀 490 nm 處測(cè)吸光度。根據(jù)酶標(biāo)儀的吸光度值計(jì)算細(xì)胞存活率，選擇存活率達(dá)到 70% 以上時(shí)的樺褐孔菌多糖濃度為安 全濃度。

多糖提取率的影響 通過對(duì)比分析分別改變提取時(shí)間、超聲功率、提取溫度、 料液比條件下樺褐孔菌多糖類物質(zhì)的提取率，結(jié)果分別顯示， 提取時(shí)間為 30 min、超聲功率為 320 W、提取溫度為 40 ℃、料 液比達(dá)到 1 g ∶ 15 mL 時(shí)，樺褐孔菌中的多糖提取量最大( 圖 1) 。因 此，選 擇 提 取 時(shí) 間 20 ～ 40 min 、超 聲 功 率 240 ～ 400 W、提取溫度 30 ～ 50 ℃、料液比 1 g ∶ ( 10 ～ 20) mL 為進(jìn)一步優(yōu)化。

通過正交試驗(yàn)確定樺褐孔菌多糖的最佳提取工藝。正交 試驗(yàn)結(jié)果表明，影響樺褐孔菌多糖類物質(zhì)提取率的因素主次 順序?yàn)?D ＞ A ＞ B ＞ C，即超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)樺褐孔菌多 糖提取效果影響相對(duì)較大，其次為提取溫度、料液比的影響。 綜合以上條件，樺褐孔菌多糖的最佳提取條件為 A2B2C1D3， 即按 1 g ∶ 20 mL 的料液比在溫度 30 ℃下提取 30 min，超聲功 率為 480 W，乙醇濃度為 30% 進(jìn)行多糖含量測(cè)定( 表 2) 。 通過對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，來分析各因素對(duì)多 糖提取率的影響。結(jié)果表明，提取時(shí)間、功率、溫度和料液比 對(duì)提取率影響顯著( 表 2) 。

3 討論與結(jié)論

非酒精性脂肪肝病( NAFLD) 的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的 趨勢(shì)，已經(jīng)成為一種嚴(yán)重危害人類健康的世界性疾病。 NAFLD 是導(dǎo)致肝功能異常的主要原因，肝臟脂肪積聚是其典 型特征，但并不能用單一的機(jī)制來解釋其發(fā)病的機(jī)制。TG 是 NAFLD 患者肝臟內(nèi)蓄積的主要脂質(zhì)，是由體內(nèi) TG 合成與轉(zhuǎn) 化失衡的結(jié)果。 HepG2 細(xì)胞已經(jīng)被成功用于脂肪肝細(xì)胞模型的建立，且 長(zhǎng)鏈脂肪酸能夠使 HepG2 細(xì)胞內(nèi)形成明顯的脂滴，進(jìn)而引起 細(xì)胞內(nèi)脂肪的堆積。因?yàn)橛坞x脂肪酸中含量最高的是油酸， 所以選擇油酸來誘導(dǎo)建立肝細(xì)胞脂肪堆積模型，是 符 合 NAFLD 形成的病理生理過程的。因此，本試驗(yàn)采用以上 誘導(dǎo)方法，在單因素的基礎(chǔ)上通過正交試驗(yàn)得到樺褐孔菌多 糖的最佳提取條件，將提取的樺褐孔菌多糖提取物作用于 HepG2 細(xì)胞，并選擇 NAFLD 的常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)來評(píng)價(jià)樺褐孔 菌多糖對(duì) 細(xì) 胞 內(nèi) 脂 肪 堆 積 的 作 用 效 果。試 驗(yàn) 結(jié) 果 表 明， 600 mg / L 樺褐孔菌多糖組的效果最顯著，TG 含量與模型組 比較 差異極顯著( P ＜ 0 ． 0 1 ) ，對(duì)細(xì)胞內(nèi)TG的清除率可達(dá)24. 57% ，并且具有劑量依賴性。說明樺褐孔菌多糖提取物具 有一定的清除細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積的作用，推測(cè)其在脂肪肝治療 方面也具有潛在的藥用價(jià)值，但目前對(duì)于樺褐孔菌多糖降脂 機(jī)制還不明確，具體的降脂機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。