用其林貝爾脫色搖床對(duì)糖尿病腎病小鼠氧化應(yīng)激

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖 尿病致死率最高的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期 腎病的主要原因。DN 的主要病理特征為腎小球基 底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)和系膜擴(kuò)張、腎小球硬化伴 有不同程度的腎間質(zhì)和腎小管損害。DN 的發(fā)病機(jī) 制包括腎素-血管緊張素-醛固酮（RAAS）激活導(dǎo)致 的血流動(dòng)力學(xué)異常和血流變因素、糖代謝紊亂、糖 基化終產(chǎn)物、各種生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激 反應(yīng)、遺傳因素等。其中，高血糖導(dǎo)致的氧化應(yīng) 激起了關(guān)鍵作用。有研究表明，核因子紅細(xì)胞衍 生 2 相關(guān)因子/血紅素氧合酶（Nrf2/HO-1）是細(xì)胞 內(nèi)抗氧化應(yīng)激最重要的通路之一。

1 材料 

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 

自發(fā)型 2 型糖尿病 C57BLKS/Jdb/db 小鼠 （db/db）10 只，雄性，9 周齡，體質(zhì)量（35.10±1.41） g（33～37 g），同遺傳背景的 C57BLKS/Jdb/+小鼠 （db/m）10 只，雄性，9 周齡，體質(zhì)量（19.84±1.18） g（18～22 g），購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，許 可證號(hào) SCXK（蘇）2018-0008。本研究已通過(guò)南開(kāi) 大學(xué)動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)。 

1.2 藥物與試劑 

五味子（天津市中藥飲片廠有限公司，批號(hào) 1806038-01），經(jīng)天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所賈淑杰主任 技師鑒定為木蘭科植物五味子 Schisandra chinensis(Turcz.) Baill. 的干燥成熟果實(shí)；小鼠尿微量白蛋白 ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；丙 二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（北京碧云天生物科技有 限公司）；過(guò)碘酸雪夫（PAS）染色試劑盒（北京索 萊寶科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 試劑盒 （北京全式金生物技術(shù)有限公司）；PCR 引物（北京 六合華大基因科技有限公司）；兔抗 Nrf2 多克隆抗 體、兔抗 HO-1 多克隆抗體、兔抗 β-actin 單克隆抗 體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG 二抗（北京 中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；自行配制 TBST 緩沖 液、5%牛奶封閉液、1×RIPA 蛋白裂解液、5×SDS、 1×Running、1×Transfer。 

1.3 主要儀器 

血糖儀、血糖試紙（羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司）； 臺(tái)式高速低溫離心機(jī)、酶標(biāo)儀（美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司）；SCIENTZ-48 高通量組織研磨器 （寧波新芝生物科技股份有限公司）；超微量分光光 度計(jì)（上海析譜儀器有限公司）；PCR 儀、瓊脂糖 凝膠電泳及成像系統(tǒng)、SDS-PAGE 電泳儀與轉(zhuǎn)膜系 統(tǒng)（美國(guó) Bio-Rad 公司）；電熱恒溫金屬浴（杭州奧 盛儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（天津化工有限公 司）；脫色搖床（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；石蠟切片機(jī)（德國(guó) Leica 公司）；CX31 正置顯 微鏡（日本 Olympus 公司）。

2 方法 

2.1 動(dòng)物分組 

10 只 C57BLKS/Jdb/db 小鼠和 10 只 db/m 小鼠 在溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（60±10）%，保持 12 h 光照/12 h 黑暗交替的動(dòng)物房中進(jìn)行飼養(yǎng)，并保 證相同自由飲水和常規(guī)飼料喂養(yǎng)，每 2 天更換 1 次 墊料。順應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后，稱體質(zhì)量并測(cè)血糖， C57BLKS/Jdb/+小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和 SE 對(duì)照組， C57BLKS/Jdb/db 小鼠隨機(jī)分為模型組和 SE 治療 組，每組 5 只。 

2.2 藥物制備 

按照 Zhang 等的方法和步驟，用乙醇循環(huán)萃 取法制備 SE，五味子 100 g 用 95%乙醇每次加熱回流 3 h，共提取 2 次，合并 2 次提取液，靜置濾過(guò)， 減壓回收乙醇濃縮成浸膏，4 ℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋 最終得到含生藥 1 mg/mL 的 SE（經(jīng)高效液相色譜 分析，SE 中五味子甲素和五味子乙素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分 別為 1.38%和 1.46%）。 

2.3 給藥方法 

小鼠 10 周齡時(shí)開(kāi)始 ig 給藥，SE 對(duì)照組與 SE 治療組給予5 mg/kg的SE（給藥前將SE放至室溫， 混勻后備用），對(duì)照組與模型組 ig 等量雙蒸水，每 天 1 次，連續(xù)給藥 6 周。

3 結(jié)果 

3.1 各組小鼠體質(zhì)量、血糖、24 h 尿微量白蛋白測(cè) 

定結(jié)果 結(jié)果如圖 1 所示，在實(shí)驗(yàn) 0 周時(shí)，與對(duì)照組相 比，模型組小鼠體質(zhì)量、血糖和 24 h 尿微量白蛋白 均顯著增高（P＜0.01）；SE 對(duì)照組與對(duì)照組比較， 體質(zhì)量、血糖和24 h尿微量白蛋白水平差異不顯著； 在 3、6 周時(shí)，SE 治療組的血糖和 24 h 尿微量白蛋 白水平明顯低于模型組（P＜0.05、0.01），但 SE 治 療組與模型組比較，小鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化；對(duì)照 組與 SE 對(duì)照組小鼠體質(zhì)量亦無(wú)明顯差異。

3.2 氧化應(yīng)激指標(biāo) 

結(jié)果如圖 2 所示，與對(duì)照組相比，模型組的 MDA 顯著升高（P＜0.01）；SE 對(duì)照組 MDA 水平 與對(duì)照組比較差異不顯著；與模型組相比，SE 治療 組的 MDA 水平顯著降低（P＜0.01）。

4 討論 

DN 是在糖尿病病程中出現(xiàn)的以蛋白尿、高血 壓、水腫、腎功能不全等腎臟病變?yōu)樘卣鞯募膊?，其早期臨床表現(xiàn)為腎小球高濾過(guò)率，尿微量白蛋白 排泄率正常，隨著病情進(jìn)展，出現(xiàn)微量白蛋白尿、 甚至大量蛋白尿、腎小球?yàn)V過(guò)率下降，最終導(dǎo)致腎 功能不可逆損害，形成終末期腎病。

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