他克莫司和西羅莫司水平分析（VORTEX-5使用）

環(huán)孢素 Ａ（ＣｓＡ）是一 種 選 擇 性 作 用 于 Ｔ 淋 巴 細 胞的免疫抑制藥，它由１１個氨基酸組成的中性環(huán) 狀多肽組成，在臨床上作為移植患者的首選藥物，當 患者出現(xiàn)效果 不 好 或 耐 受 時，改 用 他 克 莫 司，因 為 他 克莫司主要通過抑制白細胞介素－２的釋放，全面抑制 Ｔ 淋巴細胞的作用，其免疫抑制活性較環(huán) 孢 素 強１００ 倍。西羅莫司為 Ｔ 細胞活化和增殖抑制劑，具有優(yōu)于 ＣｓＡ、他克莫司的 免 疫 抑 制 活 性，其 不 僅 可 抑 制 Ｃａ２＋ 依賴性 Ｔ、Ｂ細胞的活化，也可抑制Ｃａ２＋ 非依賴性 Ｔ、 Ｂ細胞的活化，還可抑制金黃色葡萄球菌引起的 Ｂ細 胞免疫球蛋白的合成及淋巴細胞激活的殺傷細胞、自 然殺傷細胞和抗體依賴性細胞毒作用，故可治療和逆轉(zhuǎn)發(fā)展中的急性排異反應(yīng)，并可抑制生長因子導致的 成纖維母細胞、內(nèi) 皮 細 胞、肝 細 胞 和 平 滑 肌 細 胞 的 增 生，故對預(yù)防慢性排異反應(yīng)也有效。臨 床 上，為 了 達 到良好的治 療 效 果，經(jīng) 常 將 ＣｓＡ 和西 羅 莫 司 同 時 應(yīng) 用。這３種免 疫 抑 制 劑 是 白 血 病 患 者 常 用 的 抗 排 斥 藥物，由于這類藥物治療窗窄、藥動學個體差異較大， 需進行治療藥物監(jiān)測。

１ 資料與方法

１．１ 一般資料

收集２０１８年１月５日至６月５日河 北燕達陸道培醫(yī)院收治并進行ＣｓＡ、他克莫司和ＲＡＰ 免疫抑制劑治療藥物檢測的移植患者的全血標本，共 ５５０例，其中男２６０例、女２９０例，中位 年 齡２４歲，其 診斷 主 要 是 急 性 淋 巴 細 胞 白 血 病、慢 性 粒 細 胞 白 血 病、急性髓細 胞 白 血 病。在 處 理 標 本 時，嚴 格 遵 從 對 潛在生物傳染性標本處理的相關(guān)規(guī)定。使 用 時 遵 循 生物安全規(guī)則，并根據(jù)規(guī)定對廢物進行處理。

１．２ 儀 器 與 試 劑

４０００Ｑｔｒａｐ 質(zhì) 譜 儀 （ＡＢＳｃｉｅｘ）， ＡｎａｌｙｓｔＶ１．５．２ 工 作 站 （美 國 ＡＢ 公 司）；配 有 Ｓｈｉ－ ｍａｄｚｕ２０Ａ 高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司），色譜 柱為 ＵｌｔｉｍａｔｅＸＢ－Ｃ１８（上 海 月 旭 公 司）；ＶＯＲＴＥＸ ＱＩＬＩＮＢＥＩＥＲ－５（其林貝爾渦旋混合器），全自 動 高 速 冷 凍 離 心 機 （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）。 甲 醇 （ＨＰＬＣ－ Ｇｒａｄｅ，ｆｉｓｈｅｒ），屈 臣 氏 蒸 餾 水 （廣 州 屈 臣 氏）；甲 酸 （ＨＰＬＣ Ｇｒａｄｅ，ＭＲＥＤＡ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＩＮＣ）；乙 酸 銨 （ＨＰＬＣ Ｇｒａｄｅ，ＭＲＥＤＡ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＩＮＣ）；裂解液 Ａ１（七水合硫酸鋅，ＡＲ，西隴化工股份 有限公司）；ＣｓＡ、他克莫司和西羅莫司標準品（ＨＰＬＣ Ｇｒａｄｅ，ＳＩＧＭＡ）；環(huán) 孢 素 Ｄ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ｄ：ＣｓＤ， ＨＰＬＣＧｒａｄｅ，ＴｏｒｏｎｔｏＲｅｓｅａｒｃｈ）；子 囊 霉 素 （Ａｓｃｏ－ ｍｙｃｉｎ，ＨＰＬＣＧｒａｄｅ，ＴｏｒｏｎｔｏＲｅｓｅａｒｃｈ）；ＣｌｉｎＣｈｅｋ－ Ｃｏｎｔｒｏｌ：ＲＥＣＩＰＥ（ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ＋ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ ＧｍｂＨ）。

１．３ 方法

１．３．１ 色譜質(zhì)譜條件

色譜條件：采用 ＵｌｔｉｍａｔｅＸＢ－ Ｃ１８色譜柱（４．６ｍｍ×５０ｍｍ，５μｍ），柱溫６５ ℃；流 速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；流動相：２ｍｍｏＬ／Ｌ 乙酸銨－０．１％甲 酸水溶液（Ｂ）－０．１％甲酸甲醇溶液（Ａ），進樣量５μＬ； 洗脫方式：梯度洗脫，其中０．０１～０．１ｍｉｎＡ 相水平從 ５０％～１００％，保持０．９ｍｉｎ，１．０～１．１ｍｉｎＡ 相水平從 １００％～５０％，保持１．９ ｍｉｎ。質(zhì)譜 條 件：電 噴 霧 電 離 源（ＥＳＩ）；離子極性：正離子模式；監(jiān)測模式為 ＭＲＭ；離 子噴射電壓：５０００Ｖ；溫度：３２５ ℃；噴霧氣（ＧＳ１）：６５； 輔助加熱氣（ＧＳ２）：５５；氣簾氣（Ｃｕｒｔａｉｎｇａｓ）：２０；碰撞氣 壓力：Ｍｅｄｉｕｍ；用于定量分析離子分別為：ＣｓＡ 質(zhì)荷比 （ｍ／ｚ）１２１９．９００～１２０３．１００，環(huán) 孢 素 Ｄ ｍ／ｚ１２３４． ０００～１２１７．０００，他克莫司 ｍ／ｚ８２１．５～７６８．５，西羅莫 司 ｍ／ｚ９３１．７～８６４．６，子囊霉素 ｍ／ｚ８０９．４～７５６．４；各 種質(zhì)譜條件參數(shù)如表１。

１．３．２ 標準品溶液水平配制

精密稱取各標準品于 １０ｍＬ容量瓶中，用甲醇溶解成 ＣｓＡ１０５μｇ／ｍＬ、他 克莫司 １００μｇ／ｍＬ、西羅 莫 司 １０μｇ／ｍＬ、環(huán)孢 素 Ｄ １００μｇ／ｍＬ、子囊 霉 素 ２０μｇ／ｍＬ 的儲 備 液，均 置 于 －２０ ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br />
１．３．３ 血樣的處理方法

取全血１００μＬ 于１．５ ｍＬ 離心管中，加入１００μＬ裂解液 Ａ１（１００ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸 鋅水溶液），最后 加 入３００μＬ 的內(nèi) 標 混 合 液（環(huán) 孢 素 Ｄ２６ｎｇ／ｍＬ和子囊霉素２０ｎｇ／ｍＬ），渦旋混合１ｍｉｎ 后，１３０００ｒ／ｍｉｎ離心８ｍｉｎ；取上清液進樣檢測。

１．３．４ 標準曲線和檢測限

取標準品溶液適量與甲 醇混合，配制成各標準品系列水平，按照１．３．３方法處 理后進樣檢測。

１．３．５ 回收率和精密度

利用 ＲＥＣＩＰＥ 實驗室提供 的質(zhì) 控 品 （ＣｌｉｎＣｈｅｋ－Ｃｏｎｔｒｏｌ）（含 低、中、高 ３ 個 水平），按照１．３．３的處理方法進行處理，分 別 于 不 同 分 析批、批內(nèi)多次進樣（ｎ＝５），計算批內(nèi)及批間精密度 （ＣＶ％）和 相 對 回 收 率，報 道 批 內(nèi)、批 間 ＣＶ％應(yīng)＜８．３３％。

２ 結(jié) 果

利用軟件ＳＰＳＳ１９．０對 ＣｓＡ、他克莫 司和西羅莫司的檢測結(jié)果做統(tǒng)計分析，ＣｓＡ 的平均水 平為１０６ｎｇ／ｍＬ，中位水平為９６ｎｇ／ｍＬ，低于四分位 距的數(shù)據(jù)占２７．４５％，高于四分位距的數(shù)據(jù)占２４．００％；他 克莫司平均水平為５ｎｇ／ｍＬ，中位水平為４．６ｎｇ／ｍＬ， 低于四分位距 的 數(shù) 據(jù) 占２５．２７％，高于四分位距的數(shù) 據(jù)占２４．３６％；西羅莫司平均水平為５．８３ｎｇ／ｍＬ，中位 水平為４．６ｎｇ／ｍＬ，低于四分位距的數(shù)據(jù)占２６．００％， 高于四分位 距 的 數(shù) 據(jù) 占２４．５５％。因此，通 過 對 河 北 燕達陸道培醫(yī)院標本進行四分位距分析可知，ＣｓＡ、他 克莫 司 和 西 羅 莫 司 的 Ｑ１～Ｑ３ 分 別 為６１～１３９ｎｇ／ ｍＬ、２．９～６．２ｎｇ／ｍＬ 和２．８～７．３ｎｇ／ｍＬ，提示 該 院 患者抗免疫藥物水平在此區(qū)間臨床作用效果較好。

３ 討 論 　　

河北燕達 陸 道 培 醫(yī) 院 臨 床 藥 理 實 驗 室 所 建 立 的 檢測方法 簡 單、快 捷，方 法 學 穩(wěn) 定、可 靠，可 以 用 于 ＣｓＡ、他克莫司和西羅莫司的治療藥物檢測。目前國 內(nèi)免疫抑制 劑 血 藥 水 平 檢 測 中 主 要 采 用 免 疫 法， 該方法自動化 程 度 高，適 合 批 量 處 理 樣 品，但 是 由 于 選擇性不佳，存 在 交 叉 免 疫 反 應(yīng)，導致檢測結(jié)果偏高 并且不能同時檢測 ＣｓＡ、他克莫司和西羅莫司，同 時 免疫法 試 驗 成 本 較 高，增 加 實 驗 室 和 臨 床 困 難。而 ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法不存在免疫交叉反應(yīng)，其只檢測 母體藥物本身且可以同時檢測 ＣｓＡ、他克莫司和西羅 莫司，不需要分離其各種代謝產(chǎn)物，耗時短，同時其標 本處理簡單，檢測靈敏度高，利于臨床快速、準確地檢 測血藥水平。



 

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