生物接近度研究(其林貝爾QL-906使用)

鷹嘴豆 ( Cicer arietinum) 是一種豆科屬的草本類植 物，廣泛分布在亞洲南部和西部、非洲的東部和北部、 歐洲南部和北美洲等地，其中印度和巴基斯坦的種植面 積占世界種植面積的 80% 。在我國，鷹嘴豆主要分布在 新疆、甘肅、內(nèi)蒙等地，特別是在新疆的木壘縣，是鷹 嘴豆的主要產(chǎn)區(qū)，已有 2 500 年的種植歷史 。鷹嘴豆 中富含多種對人體有益的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、氨基 酸、礦物質(zhì)、維生素、不飽和脂肪酸、不溶性膳食纖 維、異黃酮、植物甾醇等，這些營養(yǎng)成分賦予鷹嘴 豆具有降血糖、降血脂和降低膽固醇等多種保健功效， 在食品、藥品領(lǐng)域具有極高的應(yīng)用價值。 

1 材料與方法

1. 1 材料與試劑

鷹嘴豆，大漠盛宴旗艦店; 甾醇標(biāo)準(zhǔn)品 ( 膽固醇、 膽甾烷醇、菜籽甾醇、麥角甾醇、菜油甾醇、菜油甾烷 醇、豆甾醇、β-谷甾醇、Δ7-燕麥甾烯醇、豆甾烷醇、Δ5- 燕麥甾烯醇) ，美國 Sigma 公司; 衍生劑 N-甲基-N-三甲基 硅烷基七氟丁酰胺∶1-甲基咪唑 ( 95∶5，v / v) ，美國 Sigma 公司; 胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶、豬膽鹽，美國 Sigma 公司; 正己烷、二氯甲烷、丙酮為色譜純; 鹽酸、乙 醚、石油醚、乙醇均為分析純，北京藍弋公司。

1. 2 儀器與設(shè)備

FreeZone 冷 凍 干 燥 機，美 國 LABCONCO 公 司; JYL-B063 九陽料理機，山東九陽股份有限公司; SER148 全自動脂肪測定儀，北京盈盛恒泰科技有限公司; MDF382E ( N) 超低溫冰箱，日本 SANYO 公司; FW100 高速 萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司; FA1004 電子 天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司; 全波長酶標(biāo)儀，美國 Thermo 公司; 其林貝爾QL-901 渦旋振蕩器，江蘇其林貝爾 儀器制造有限公司; NK200-18 可視孔氮吹儀，杭州米歐 儀器有限公司; TGL-16 臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀 離心機儀器有限公司; HH-8 電熱恒溫水浴鍋，上海棱光 技術(shù)有限公司; 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 ( GCMS-TQ8040) ， 日本 島 津 公 司; 硅 膠 固 相 萃 取 小 柱 silica 0. 5 g /6mL ( SPE) ，北京迪馬公司; HH-8 電熱恒溫水浴鍋，上海棱 光技術(shù)有限公司; P70D20TL-D4 微波爐，廣東格蘭仕微波 生活電器制造有限公司; Hiperbaric-135 超高壓非熱殺菌 設(shè)備，東莞市萊曼五金機械有限公司。

1. 3 試驗方法

1. 3. 1 鷹嘴豆預(yù)處理

將鷹嘴豆粉碎，置于 － 80℃ 超 低溫冰箱中進行預(yù)凍處理，之后冷凍干燥48 h 以除去粉 末中剩余水分，于 － 20℃低溫凍藏備用。

1. 3. 2 鷹嘴豆中油脂的提取

取 1 ～ 3 g 經(jīng) 1. 3. 1 預(yù)處 理并凍存的鷹嘴豆粉末放于濾紙筒，濾紙筒放入提取筒 中，加入 30mL 石油醚。將提取筒放入自動脂肪提取儀， 65℃加熱 1 h，提起提取筒，65℃繼續(xù)抽提 1. 5 h，差量 法獲得油脂數(shù)據(jù)。將油脂于 － 20℃保存?zhèn)溆谩?br />
1. 3. 3 鷹嘴豆中游離甾醇的提取

取 50 mg1. 3. 2 所制 備的油脂樣品，加入 20 μg 膽甾烷醇內(nèi)標(biāo)，用 5mL 正己 烷溶液溶解，渦旋振蕩均勻，備用。稱取 1. 0 g 無水硫 酸鈉加到固相萃取小柱的上方，然后用 10mL 正己烷溶 液活化，流速 1. 5mL/min，棄去流出液。將 5mL 樣品液 注入到固相萃取小柱中，控制流速 1. 2mL/min，棄去流出液。用 10mL 體積分?jǐn)?shù) 5% 乙醚-正己烷溶液進行淋洗， 除去甘油三酯和甾醇酯類化合物，流速控制在 1. 2mL/ min，棄去流出液。用 10mL 體積分?jǐn)?shù)為 20% 乙醚-正己 烷溶液洗脫游離甾醇并收集于潔凈干燥的試管中，流速 控制在 1. 5mL/min。氮吹吹干有機相，4℃貯藏備用。

1. 3. 4 鷹嘴豆中總甾醇的皂化和提取

取 50 mg1. 3. 2 所制備的油脂樣品，加入 20 μg 膽甾烷醇作為內(nèi)標(biāo)，加 入 2mol /L 氫氧化鉀-乙醇溶液 4mL，二氯甲烷 0. 5mL， 渦旋振蕩 1min 混勻。25℃ 水浴振搖 18 h。加入二氯甲 烷 5mL，超純水 3mL，輕輕混合均勻以免產(chǎn)生泡沫，去 除上清后，再用 5mL 超純水清洗 3 次，棄上清，氮吹吹 干有機相，4℃貯存?zhèn)溆?。由總甾醇和游離甾醇相減得 到結(jié)合甾醇含量。

1. 3. 5 鷹嘴豆中結(jié)合態(tài)甾醇含量的測定

由總甾醇含 量減去游離甾醇含量得到每種結(jié)合態(tài)甾醇的含量。

1. 3. 6 鷹嘴豆中植物甾醇的分析鑒定

( 1) 色譜條 件: 載氣: 氦 氣 ( 純 度 99. 999% ) ; 色 譜 柱: DB-5MS 色譜 柱 ( 30m × 0. 25mm × 0. 25μm) ; 進 樣 口 溫 度: 290℃; 分流進樣: 20∶1; 進樣量: 1μL; 流速: 1. 2mL/ min; 程 序 升 溫: 初 始 溫 度 100℃ ( 保 持 1min) ，以 40℃ /min 升至290℃ ( 保持15min) 。
( 2) 質(zhì)譜條件: 電 離方式: EI; 電離能量: 70 eV; 離子源溫度: 250℃; 傳輸線溫度: 290℃; 監(jiān)測方式: SIM 模式。
( 3) GCMS 檢測: 稱取各甾醇標(biāo)準(zhǔn)品 5mg ( β-谷甾醇 10mg) ， 分別 用 丙 酮 配 置 濃 度 梯 度 為 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、 0. 5mg /mL 的甾醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，氮吹吹干。將上述制備 的甾醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、1. 3. 3 和 1. 3. 4 提取的甾醇樣品中 均加入 100 μL 衍生劑于 75℃衍生 20min，正己烷定容到 1mL，進樣 1 μL 用 GC-MS 檢測。樣品中所含有的植物甾 醇定性鑒定采用與甾醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時間的比對及質(zhì)譜 庫檢索的方法進行。樣品中植物甾醇定量分析采用內(nèi)標(biāo) 法，依據(jù)總離子流色譜圖峰面積計算每種甾醇的含量。

1. 3. 7 鷹嘴豆熱處理

按 1∶1 ( m/ v，g /mL) 比例加入 鷹嘴豆和超純水，于 4℃下泡豆 6 h。取適量浸泡好的鷹 嘴豆倒入燒杯中，按上述比例加入超純水。80℃水浴加 熱，期間不斷攪動，使鷹嘴豆受熱均勻，分別在 2、6、 10、30、50min 等 5 個時間點對鷹嘴豆取樣。勻漿后， 4℃貯藏備用。

1. 3. 8 鷹嘴豆微波處理

取適量按 1. 3. 7 方法所浸泡 好的鷹嘴豆倒入燒杯中，按 1∶1 ( m/ v，g /mL) 比例加 入超純水。微波加熱處理，額定功率 350 W，分別在 1、 2、6、10、15min 等 5 個時間點對鷹嘴豆取樣。勻漿后， 4℃貯藏備用。

1. 3. 9 鷹嘴豆超高壓處理

取適量按 1. 3. 7 方法所浸泡好的鷹嘴豆，按 1∶1 ( m/ v，g /mL) 比例加入超純水， 勻漿處理。將鷹嘴豆勻漿分裝于耐高壓包裝袋中，分裝 完成后用真空封口機封口，盡量避免樣品與熱封機封口 條接觸。將分裝好的樣品放入高壓反應(yīng)釜中，浸沒于傳 壓介質(zhì) ( 本試驗為水) 中，在 20℃、壓力 400MPa 下進 行處理，分別在 1、2、6、10、15min 等 5 個時間點對鷹 嘴豆取樣。壓力升至設(shè)定壓力時開始計時，到達處理時 間后設(shè)備自動泄壓，超高壓處理結(jié)束后，將樣品立即放 入冰浴中冷卻，于 4℃貯藏備用。

2 結(jié)果與分析

結(jié)合甾醇所占比例較小。與其他研究結(jié)果相 比，本研究利用固相微萃取方法提取分離出鷹嘴豆中總 游離甾醇，并對其種類和含量進行分析鑒定，所獲得的 研究結(jié)果對鷹嘴豆中植物甾醇的存在形態(tài)給出了明確的 結(jié)果，這對鷹嘴豆中所含有的營養(yǎng)成分進行了有力的補 充，從而促進鷹嘴豆在藥食同源中的廣泛應(yīng)用。而具體 的結(jié)合態(tài)甾醇存在形式還需做進一步分析驗證。與其他 豆類相比，鷹嘴豆中植物甾醇總量和紅豆相似，低于大 豆、綠豆、黑豆等植物甾醇總量 。韓軍花在對不 同豆類中總甾醇含量進行分析時，發(fā)現(xiàn)植物甾醇含量可 能與豆類中碳水化合物的含量有關(guān)，碳水化物含量高的 豆類中植物甾醇含量相對較低。與對照組相比，對鷹嘴豆勻漿熱處理 2min 時，植物甾醇的生物接近度略微升高，但升高幅度 不顯著，之后隨加熱時間的延長，植物甾醇生物接近度 持續(xù)顯著地下降。當(dāng)處理時間達 30min 后，生物接近度 不再發(fā)生顯著變化。許多研究表明，食物在經(jīng)過熱加工 后，由于食物基質(zhì)和顆粒遭到一定的破壞，會促進營養(yǎng) 素的釋放，從而增加營養(yǎng)素的生物接近度。不過也有一 些研究表明，熱加工過程對某些營養(yǎng)素生物接近度增加 不明顯，甚至還會降低，比如 Rock 等研究發(fā)現(xiàn)， 熱加工處理降低了胡蘿卜和菠菜中 β-胡蘿卜素的生物接 近度。試驗結(jié)果表明，對鷹嘴豆短時間的熱處理會一定 程度提升甾醇的生物接近度，但是隨著熱處理時間的延 長，植物甾醇的生物接近度將顯著下降，這可能是因為 輕微的加熱促進甾醇從食物基質(zhì)中釋放出來，有助于甾 醇膠束化結(jié)構(gòu)的生成。而過度長時間加熱可能導(dǎo)致鷹嘴 豆細胞結(jié)構(gòu)被破壞，使甾醇在胃腸液中被迅速消化降 解。也可能是因為破壞了甾醇膠束化結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，導(dǎo) 致膠束化率降低，從而影響其在人體內(nèi)的吸收。研究結(jié) 果表明，在鷹嘴豆食用過程中，進行較短時間的熱處理 有利于保持其中植物甾醇的生物接近度。

3 結(jié)論

利用 GC-MS 方法分析了鷹嘴豆油脂中植物 甾醇的種類、含量及存在形態(tài)，并對經(jīng)加熱、微波及超 高壓處理的鷹嘴豆中植物甾醇生物接近度變化情況進行 了研究。結(jié)果表明，鷹嘴豆中主要含有 β-谷甾醇、菜油 甾醇、Δ5-燕麥甾烯醇、豆甾醇、豆甾烷醇、Δ7-燕麥甾 烯醇，此外還含有微量的膽固醇和菜油甾烷醇。所鑒定 出的上述 8 種植物甾醇中均主要以游離甾醇形式存在， 結(jié)合甾醇所占比例較小。體外模擬消化實驗表明，鷹嘴 豆中植物甾醇的生物接近度較低。加熱、微波及超高壓 處理均會導(dǎo)致鷹嘴豆中植物甾醇生物接近度不同程度的 下降，食用過程中可以采用較短時間的熱處理或者微波 處理來最大程度降低植物甾醇生物接近度的下降。

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