肺炎鏈球菌調(diào)理吞噬作用的比較(其林貝爾振蕩器

肺炎鏈球菌( Streptococcus pneumonia) 是引起肺 炎、腦膜炎、中耳炎及敗血癥的主要病原之一，特別 在兒童和老年人中。接種疫苗是預(yù)防肺炎鏈球 菌相關(guān)疾病的重要手段，為了保證肺炎鏈球菌疫苗 的質(zhì)量，WHO 建議肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗的臨床評(píng)價(jià) 應(yīng)以型別特異性抗體水平作為第一臨床終點(diǎn)的判斷指標(biāo)。

1 材料與方法

1．1 胎牛血清

5 個(gè)不同品牌的胎牛血清( 簡(jiǎn)稱(chēng)品 牌 1～5) 分別購(gòu)自美國(guó) Gibico 公司、Clark 公司、Corning 公司、Seropro 公司和杭州四季青公司。

1．2 菌種、細(xì)胞

13 株肺炎鏈球菌菌株均來(lái)自中國(guó) 醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。其中，CMCC( B) 33273( 1 型) 、33278( 6B 型) 、33284( 19F 型) 均為壯觀霉素 ( spectinomycin) 抗性; CMCC( B) 33274( 3 型) 、33275 ( 4 型) 、33279( 7F 型) 、33279( 18C 型) 均為奧普托 欣( optochin) 抗性; CMCC ( B) 33276 ( 5 型) 、33280 ( 9V 型) 、33281( 14 型) 均為鏈霉素( streptomycin) 抗性，CMCC ( B) 33277 ( 6A 型) 、33283 ( 19A 型) 、 33285( 23F 型) 均為甲氧芐氨嘧啶( trimethoprim) 抗 性。HL60 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó) ATCC( CCL-240) ，由中國(guó) 食品藥品檢定研究院保存并提供。

1．3 質(zhì)控血清

007sp 購(gòu)自英國(guó)生物制品檢定所 ( National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC) ; 920 由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任 公司惠贈(zèng); 2009S 由中國(guó)食品藥品檢定研究院呼吸 道細(xì)菌疫苗室制備。

1．4 主要試劑及儀器

ＲPMI1640 培養(yǎng)基、谷氨酰 胺、Hanks 緩沖液( HBSS) 均購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司; 二甲基甲酰胺( DMF) 購(gòu)自美國(guó) Fisher 公司; 家兔補(bǔ) 體由中國(guó)食品藥品檢定研究院呼吸道細(xì)菌疫苗室制 備; Todd Hewitt Broth、酵母粉、瓊脂粉均購(gòu)自美國(guó) BD 公司; 壯觀霉素、奧普托欣、鏈霉素、甲氧芐氨嘧 啶、2，3，5-氯化三苯基四氮唑( TTC) 均購(gòu)自 Sigma 公司。顯微 鏡 購(gòu) 自 Olympus 公 司; CO2 培 養(yǎng) 箱 購(gòu) 自 Thermo 公司; 微孔板振蕩器購(gòu)自其林貝爾公司; 菌落計(jì)數(shù)器 ProtoCOL3 購(gòu)自 Synbiosis 公司。

1．5 不同品牌血清用于 HL-60 分化后細(xì)胞活力的比較

培養(yǎng)時(shí)間相同的增殖 HL-60 細(xì)胞，取一定體 積計(jì)數(shù)，分裝至 5 支離心管中，使每支離心管中有 4×107 個(gè)細(xì)胞，以離心半徑 8 cm、1 500 r/min 離心 5 min; 用品牌 1 ～ 5 的胎牛血清配制用于 HL-60 分 化的細(xì)胞培養(yǎng)基 CM2，輕輕重懸細(xì)胞沉淀; 將體 積加至 100 mL，于 37 ℃ 0．5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～ 6 d 后，以離心半徑 8 cm、1 500 r/min 離心 5 min，去 上清; 分別用1×HBSS 緩沖液( 無(wú) Ca2+ 、Mg2+ ) 和 1× HBSS 緩沖液( 含 Ca2+ 、Mg2+ ) 清洗細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染 色記錄活細(xì)胞和死細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞活力。

1．6 不同品牌血清分化的細(xì)胞對(duì) 13 個(gè)不同肺炎鏈球菌血清群/型調(diào)理吞噬作用的影響

用品牌 1 配 制的 OBB 將上述不同胎牛血清分化的細(xì)胞濃度調(diào) 整為 1×107 個(gè)/mL。OPA 滴度檢測(cè)采用可同時(shí)檢測(cè) 4 種血清型的多型調(diào)理吞噬試驗(yàn)( multiplexed opsonophagocytic killing assays，MOPA) ，具體操作流程 見(jiàn)參考，每輪 MOPA 中的每份質(zhì)控血清均 平行測(cè)定 2 次。當(dāng)對(duì)照孔菌數(shù)的平均值在 70 ～ 180 CFU/spot，非特異殺菌率≤70%時(shí)，計(jì)算每份質(zhì)控血 清的調(diào)理指數(shù)( opsonic index，OI) ，取平均值作為每 輪試驗(yàn)的結(jié)果值，重復(fù) 3 次，計(jì)算每份質(zhì)控血清調(diào)理 指數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1．7 不同品牌血清配制成 OBB 后對(duì) 13 個(gè)不同肺 炎鏈球菌血清群/型調(diào)理吞噬作用的比較

用品牌 1 配制的 CM2 培養(yǎng)基培養(yǎng) HL-60 5～6 d 后，按照 1．5 項(xiàng)方法處理細(xì)胞，最后用不同品牌血清配成的 OBB 調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×107 個(gè)/mL。MOPA 試驗(yàn)及結(jié)果 計(jì)算按照 1．6 項(xiàng)方法進(jìn)行。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1．8．1 細(xì)胞活力的比較

采用 IBM SPSS Statistics 19．0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以 x 珋± s表示，多組間比較采用單因素方差分析 ( oneway ANOVA) ，以品牌 1 為對(duì)照，比較與其余品牌的 差異，P＜0．05 時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1．8．2 調(diào)理指數(shù)的計(jì)算及分析

采用 Opsotiter3 軟 件計(jì)算 OI 值，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以 x 珋± s 表示。

2 結(jié) 果

品牌 1 胎牛血清分化細(xì)胞的活力最高，為86．80%; 品牌 4 分化細(xì)胞的活力次之( 76．23%) ; 品牌 2 和 3 分化細(xì)胞的活 力相近 ( 分 別 為 71． 24% 和 72．73) ; 品牌 5 分化細(xì)胞的活力最低( 64．80%) 。與品 牌 1 胎牛血清分化細(xì)胞的活力相比較，品牌 2、3、4 分 化細(xì)胞的活力，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P 值分別為 0．129、0．186、0．440，P＞0．05) ，而品牌 5 分化細(xì)胞的活 力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P= 0．023，P＜0．05)。

3 討 論

為保證疫苗質(zhì)量，所有肺炎鏈球菌疫苗上市前 均需進(jìn)行免疫保護(hù)效力測(cè)定。肺炎鏈球菌疫苗的保 護(hù)機(jī)制主要是通過(guò)特異性抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用 將體內(nèi)的肺炎鏈球菌清除。通過(guò) OPA 檢測(cè)抗體的 調(diào)理吞噬活性，能夠直接反映功能性抗體含量，實(shí)現(xiàn) 對(duì)疫苗保護(hù)效力的準(zhǔn)確評(píng)估。OPA 技術(shù)在國(guó)內(nèi) 外疫苗監(jiān)管體系中受到越來(lái)越多的重視，2013 年美 國(guó)惠氏公司的 13 價(jià)肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗在歐洲被 批準(zhǔn)用于 50 歲以上成人使用時(shí)，采用 OPA 技術(shù)進(jìn) 行臨床效果評(píng)價(jià); 2015 年美國(guó)默沙東公司新注冊(cè)的 15 價(jià)肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗使用 OPA 進(jìn)行了臨床評(píng)價(jià); 近年來(lái)，我國(guó)新藥評(píng)審機(jī)構(gòu)要求肺炎鏈球菌 疫苗上市前需對(duì)一定比例的臨床樣本采用 OPA 進(jìn) 行臨床效果評(píng)價(jià)。OPA 的穩(wěn)定性和可重復(fù)性是臨 床效果評(píng)價(jià)的前提條件，而胎牛血清作為細(xì)胞分化 和調(diào)理緩沖液配制中的重要試劑，在美國(guó)阿拉巴馬 大學(xué)發(fā)布的“肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體多型 調(diào)理吞噬試驗(yàn)手冊(cè)”中明確規(guī)定“由于非特異殺傷 等問(wèn)題，需要對(duì)配制 OBB 的胎牛血清進(jìn)行篩選。” 胎牛血清的主要成分為蛋白質(zhì)、多肽、激素等，在含 量或特殊成分濃度、質(zhì)量的差別可以對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng) 造成影響。胎牛血清成分復(fù)雜，而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng) 的作用機(jī)制也同樣復(fù)雜，目前仍有某些成分不清楚 或者作用機(jī)理尚在探索中。



 

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