豆蔻?；鞍准っ窩表達(dá)的影響-QL-902使用

缺血性中風(fēng)是常見(jiàn)的危害人類神經(jīng)系統(tǒng)的疾病， 占腦中風(fēng)比例較大。PKC-MARCKS 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)腦 缺血后被激活，豆蔻?；鞍准っ?C（MARCKS）在 神經(jīng)功能和神經(jīng)疾病中扮演重要的角色，其為蛋白 激酶 C（protein kinase C，PKC）的特異性底物蛋白。 MARCKS 能調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)、內(nèi)吞和胞吐 及突觸可塑性等基本過(guò)程，揭示 MARCKS 蛋白在一 系列生理過(guò)程是一個(gè)不可或缺的參與者，參與了大腦 皮層的發(fā)育與衰老相關(guān)的認(rèn)知能力下降等過(guò)程。目 前，已知的關(guān)于 MARCKS 的調(diào)節(jié)機(jī)制均與 PKC 磷酸 化有關(guān)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

健康雄性 SD 大鼠 80 只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量 250～ 300 g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心提供， 動(dòng)物許可證號(hào) SYSK（黑）2013-012。飼養(yǎng)于溫度 （20±2）℃、相對(duì)濕度 40%～42%環(huán)境，12 h 光照， 自由攝食飲水。

1.2 藥物

芪蛭膠囊（黃芪 30 g、丹參 20 g、水蛭 15 g、地 龍 15 g 等），黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房 提供，批號(hào) 170301；尼莫地平片，哈藥集團(tuán)三精明水 藥業(yè)有限公司，批號(hào) 20180524。

1.3 主要試劑與儀器

兔抗 MARCKS（20661-1-Ap，Proteintech），兔 抗 p-MARCKS（11992，CST），山羊抗兔 IgG（H+L） HRP（天德悅 S004），山羊抗小鼠 IgG（H+L）HRP （天德悅 S001），GAPDH 鼠單抗（天德悅 TDY042）， 超純RNA提取試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581）， HiFi-MMLV cDNA 第一鏈合成試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744）。渦旋振蕩儀（其林貝爾 QL-902）， 離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5415D），分光光度計(jì) （Therno Scientific，NANODROP 2000），熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems，ABI7500），F(xiàn)resco 低 溫冷凍離心機(jī)（ Thermo ）， MultiSkan3 酶標(biāo)儀 （Thermo），Mini P-4 電泳槽（Cavoy）。

1.4 分組及給藥

實(shí)驗(yàn)大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型 組、陽(yáng)性藥組和中藥組，其中假手術(shù)組 6 只，其余 3 組各 24 只。根據(jù)人與動(dòng)物給藥劑量比例換算，大鼠 用藥劑量＝人用藥劑量×0.018÷200 g。中藥組給予 芪蛭膠囊（2.6 mg/mL）藥液灌胃，陽(yáng)性藥組給予尼 莫地平（3 mg/mL）藥液灌胃，假手術(shù)組和模型組給 予等體積生理鹽水灌胃。給藥體積 10 mL/kg，每日 1 次，連續(xù) 8 d。模型組、中藥組和陽(yáng)性藥組根據(jù)缺血 2 h 再灌注后時(shí)間不同隨機(jī)分為再灌注后 6、24、72 h 和 7 d 共 4 個(gè)亞組。

1.5 造模

第 8 日給藥 1 h 后開(kāi)始造模。采用 Zea Longa 線 栓法制作大鼠腦缺血損傷動(dòng)物模型，即大腦中動(dòng)脈 阻塞模型。大鼠腹腔注射 10%水合氯醛（35 mg/kg） 麻醉，仰臥位固定，于頸部正中線處做一縱切口，分 離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi) 動(dòng)脈（ICA）。然后在近心端結(jié)扎 CCA、ECA，用小 動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉 CCA 遠(yuǎn)心端近分叉部，然后在 CCA 近心端距分叉部4 mm剪一小口，將栓線插入到CCA， 輕推栓線達(dá)分叉處，松開(kāi)小動(dòng)脈夾，從血管分叉處進(jìn) 入 ICA，從分叉處插入深度約 18 mm，于 CCA 遠(yuǎn)心 端用細(xì)線結(jié)扎，消毒后縫合傷口。術(shù)后 2 h 將栓線拔 出約 1 cm，行再灌注。假手術(shù)組大鼠不插入栓線，其 余步驟同其他組。

1.6 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

參照 Zea Longa 5 分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)成模大鼠進(jìn) 行初選：無(wú)神經(jīng)缺損癥狀，0 分；不能充分伸展左側(cè) 前肢，1 分；行走時(shí)身體向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，2 分；行走時(shí)身體向左側(cè)傾倒，3 分；不能自發(fā)行走，意識(shí)水平喪 失，4 分。選取 1～3 分者，將不合格大鼠剔除，通過(guò) 隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊動(dòng)物數(shù)并重新造模。

1.7 標(biāo)本處理

所有實(shí)驗(yàn)組各取 2 只大鼠行腦組織 HE 染色，腦 組織標(biāo)本制作經(jīng)心臟灌流。大鼠腹腔注射 10%水合氯 醛（35 mg/kg）麻醉，先灌注生理鹽水約 100 mL，再 灌注 4%多聚甲醛緩沖液。灌注固定完成后，迅速剪 取大鼠頭部，用彎鉗小心將缺腦組織剝離，切取 2 mm2 缺血區(qū)腦組織，4%多聚甲醛緩沖液 4 ℃固定 24 h， 組織脫水、透明及浸蠟，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片， HE 染色。各組余下 4 只大鼠，其中 2 只用于大鼠腦 組織 Western blot 檢測(cè)，另外 2 只用于大鼠腦組織 RT-PCR 檢測(cè)。模型大鼠麻醉后冰上斷頭取腦組織， 剝離腦組織至冰上，刀片切取缺血區(qū)腦組織，置于凍 存管中液氮保存，提取總蛋白及總 RNA 備用。

1.8 Western blot 檢測(cè)豆蔻?；鞍准っ?C 及其磷酸化蛋白表達(dá)

將缺血區(qū)腦組織剪碎，提取總蛋白。加裂解液， 腦組織 15 000 r/min 勻漿 10 s，冰上孵育 20 min，4 ℃、 13 000 r/min 離心 20 min，取上清液，應(yīng)用 BCA 法蛋 白定量，酶標(biāo)儀讀取 OD 值，分裝后置于-80 ℃冰箱 保存。以 RIPA 調(diào)整蛋白濃度，根據(jù)目的蛋白分子量， 配制 12%分離膠，濃縮膠濃度為 5%，20 μg/孔上樣， 通過(guò)預(yù)染蛋白 Marker 確定電泳停止時(shí)間，然后進(jìn)行 轉(zhuǎn)模和染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。用 3%BSA-TBST 稀釋 MARCKS、p-MARCKS 蛋白，濃度分別為 1∶4000 和 1∶500，室溫孵育 10 min，4 ℃過(guò)夜。第 2 日膜處 理后曝光，顯影 2 min，定影。拍照保存圖像，分析 軟件測(cè)定條帶光密度值，以光密度值代表蛋白的相對(duì) 表達(dá)量。

1.9 RT-PCR 檢測(cè)豆蔻?；鞍准っ?C mRNA 表達(dá)

用超純 RNA 提取試劑盒提取組織樣本中總 RNA，實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取 5 μL RNA，1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè) RNA 的完整性。設(shè)計(jì) 引物 MARCKS mRNA，用 GAPDH 作內(nèi)參。引物設(shè) 計(jì)見(jiàn)表 1。用 UltraSYBR Mixture（With ROX）進(jìn)行 擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。擴(kuò)增步驟： 95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，共 45 個(gè) 循環(huán)。取 5 μL RNA，1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。選取 樣本 cDNA 進(jìn)行 5 倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取 2 μL 作為模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行 擴(kuò)增，同時(shí) 60～95 ℃進(jìn)行融解曲線分析，儀器自動(dòng) 繪制出對(duì)應(yīng)的內(nèi)參基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù) RT-PCR 原始檢測(cè)結(jié)果，用 2-ΔΔCt 法分析基因的相對(duì)表 達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 — x±s 表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用 LSD 法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

除假手術(shù)組外，其余大鼠自缺血再灌注后 6 h 起 即有明顯的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，多數(shù)大鼠出現(xiàn)患側(cè)肢 體屈曲內(nèi)收、雙側(cè)伸出不對(duì)稱的癥狀，缺損癥狀明顯 者多出現(xiàn)行走時(shí)向患側(cè)轉(zhuǎn)圈，癥狀越重則旋轉(zhuǎn)直徑越 小，可出現(xiàn)行走時(shí)追尾。模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分缺 血再灌注后各時(shí)間點(diǎn)整體水平呈下降趨勢(shì)，中藥組、 陽(yáng)性藥組較模型組整體評(píng)分降低，再灌注后 72 h 中藥 組和陽(yáng)性藥組較模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），再灌注后 7 d 中藥組較模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P＜0.05）?？梢?jiàn)大量紫色深染的凋亡小體，炎性細(xì)胞及膠質(zhì)浸 潤(rùn)，增生明顯；陽(yáng)性藥組大鼠較模型組神經(jīng)元水腫有 所減輕，細(xì)胞周圍間隙有所減輕，網(wǎng)格排列情況較輕， 可見(jiàn)少量紫色深染的凋亡小體；中藥組大鼠較模型組 神經(jīng)元水腫減輕，細(xì)胞周圍間隙減小，未見(jiàn)網(wǎng)格排列 情況，未發(fā)現(xiàn)大空泡；中藥組和陽(yáng)性藥組大鼠再灌注 后 72 h 較模型組形態(tài)差異最明顯，神經(jīng)元損傷減少， 神經(jīng)元數(shù)量增加，神經(jīng)元腫脹明顯減輕，可見(jiàn)少量紫 色深染的凋亡小體。

3 討論

氣虛血瘀夾痰是缺血性中風(fēng)主要病因病機(jī)。氣虛 為本，血瘀為標(biāo)，瘀血既成，影響氣生血及行血，又 使腦絡(luò)瘀阻加重。血瘀是缺血性中風(fēng)的病理核心，氣 虛是本病的根源；痰是臟腑功能失調(diào)的一種病理產(chǎn) 物，亦是導(dǎo)致缺血性中風(fēng)的基本病理因素之一。故缺 血性中風(fēng)治以益氣活血、祛痰通絡(luò)，則血行氣旺，血 足氣暢，絡(luò)通風(fēng)消，諸癥痊愈。芪蛭膠囊具有益氣活 血、化瘀祛痰、通經(jīng)活絡(luò)功效。方中黃芪為君藥，性 甘溫，大補(bǔ)元?dú)?，氣足則血生，氣旺促血行；輔以水 蛭、地龍破血逐瘀、通經(jīng)活絡(luò)；丹參補(bǔ)血、活血化瘀； 水蛭、地龍與丹參等同用，旨在祛瘀通絡(luò)、活血化瘀 而不傷正。諸藥合用，共奏益氣活血、祛瘀化痰、通 經(jīng)活絡(luò)功效。

 

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