大豆肽鈣螯合物的制備-QB-9002使用

鈣是維持人類生命健康重要的礦物質(zhì)之一，其 約占成年人體重的 2% ，缺鈣會增加人體骨折和患 骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險，隨著全球人口老齡化現(xiàn)象的加 劇，研究新型鈣補充劑，以增加人體對鈣的吸收利 用率越來越受到人們的關(guān)注。另外，鈣還具有 參與細(xì)胞內(nèi)代謝、凝血、神經(jīng)傳導(dǎo)、骨骼生長等重 要功能。

1 材料與方法

1． 1 實驗材料

低溫脫脂豆粕，山東禹王集團(tuán); 堿性蛋白酶，諾 維信( 中國) 生物技術(shù)有限公司。氫氧化鈉、鹽酸、 無水氯化鈣、無水乙醇、硝酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫 鈉，分析純; 乙腈，HPLC。 K9840 自動凱氏定氮儀，Himac CＲ21 GⅡ型冷 凍離心機，恒溫干燥箱，AA － 240 原子吸收分光光 度計( 火焰型) ，D － 2000 Elite 高效液相色譜儀， 835 － 50 型氨基酸自動分析儀，Nano Brook Omni 型 多角度粒度與高靈敏度 Zeta 電位分析儀，尼魯噴霧 干燥機，制備級高效液相色譜儀，X 射線衍射儀， DSC3 型差示掃描量熱儀，TGA2 型熱重分析儀。

1． 2 實驗方法

1． 2． 1 大豆肽的制備

將低溫脫脂豆粕粉碎后，按料液比 1∶ 5 加 85% 乙醇醇洗 60 min，42 ℃干燥后，按料液比 1∶ 9 加入去 離子水，于 pH 4． 5 條件下酸沉 1 h，8 500 r/min 離 心 30 min，沉淀加入 9 倍體積的去離子水充分分散，于 pH 9． 0、60 ℃ 條件下加入 2% 的堿性蛋白酶水解 4 h，調(diào) pH 至中性滅酶，8 500 r/min 離心 30 min，上 清噴霧干燥，即得大豆肽。

1． 2． 2 大豆肽鈣螯合物的制備

配制 100 mL 4% 的大 豆 肽 溶 液，調(diào) 節(jié) pH 至 7. 8，加入 4 mL 2 mmol /L 的 CaCl2 溶液，于 40 ℃ 恒 溫水浴振蕩器中反應(yīng) 1 h，4 000 r/min 離心 10 min， 上清中加入 8 倍體積無水乙醇，靜置 30 min，離心， 加入 85% 乙醇洗兩次，每次醇洗時間為 30 min，離 心后沉淀于 42 ℃烘干，即得大豆肽鈣螯合物。

1． 2． 3 大豆肽鈣螯合物在磷酸鹽溶液中的穩(wěn)定性

向 pH 8． 0 的磷酸鹽( 10 ～ 200 mmol /L) 緩沖液 ( PBS) 中添加大豆肽鈣螯合物，使溶液中鈣含量為 1 mg /mL，于 37 ℃下振蕩水浴 30 min，離心后，測定 上清中鈣含量，計算鈣保留率，同時，向溶液中添加 相同含量的 CaCl2作對照。鈣保留率按下式計算。 鈣保留率 = 離心后上清中鈣含量/溶液中鈣含 量 × 100%

1． 2． 4 氨基酸組成的測定

采用 OPA FMOC 柱前衍生，通過氨基酸自動分 析儀進(jìn)行測定。稱取約 0． 1 g 大豆肽或大豆肽鈣螯 合物于水解管內(nèi)，加入 8 mL 6 mol /L 的 HCl 溶液， 混勻后放于 110 ℃ 的烘箱內(nèi)消解 22 h。取出冷卻， 將消解液轉(zhuǎn)移到 25 mL 容量瓶中，用 4． 8 mL 10 mol /L 氫氧化鈉溶液中和，并用水定容至刻度。采 用雙層濾紙過濾，取 1 mL 濾液離心( 10 000 r/min， 10 min) ，取上清液進(jìn)行測定。

1． 2． 5 大豆肽鈣螯合物的脫鈣

稱取 25 mg 大豆肽鈣螯合物，加入 5 mL 0． 2 mol /L 的 pH 8． 0 PBS 中，于微孔板快速振蕩器（海門市其林貝爾微孔板快速振蕩器QB-9002型）上振蕩 5 min，10 000 r/min 離心 10 min，上清液為脫鈣后的 大豆肽鈣螯合物。該方法可脫除大豆肽鈣螯合物中 99% 以上的鈣，且大豆肽無損失。

1． 2． 6 大豆肽鈣螯合物在不同 pH 條件下的穩(wěn)定性

將一定量的大豆肽鈣螯合物溶解于去離子水 中，使溶液中鈣含量為 1 mg /mL，分 別 調(diào) pH 至 2． 0 ～ 8． 0，于 37 ℃ 下振蕩水浴 2 h，離心( 10 000 r/min，10 min) ，測定上清的相對分子質(zhì)量。

1． 2． 7 Zeta 電位分析

參考劉成梅等的方法并加以改進(jìn)。將大豆 肽或大豆肽鈣螯合物配制成 0． 1% 的溶液，調(diào)節(jié) pH 至 7． 8，進(jìn)行 Zeta 電位的測定。

1． 2． 8 XＲD 分析

分別將大豆肽、氯化鈣、大豆肽鈣螯合物制成粉末，進(jìn)行 XＲD 分析，掃描角度 5° ～ 90°。 1． 2． 9 DSC 分析 分別稱取 3 mg 左右的大豆肽及大豆肽鈣螯合 物于坩堝內(nèi)，置于差示掃描量熱儀中，進(jìn)行熱穩(wěn)定性 分析，同時進(jìn)行空白對照。溫度范圍 25 ～ 200 ℃，升 溫速度 10 ℃ /min，N2流速 50 mL /min。

1． 2． 10 TGA 分析

分別稱取大豆肽及大豆肽鈣螯合物 3 mg 于坩 堝中，將坩堝置于熱重分析儀中，測定溫度 25 ～ 900 ℃，升溫速度 10 ℃ /min，N2 流速 30 mL /min，記 錄樣品質(zhì)量，計算并繪制質(zhì)量損失率曲線。 1． 2． 11 數(shù)據(jù)處理 所有實驗數(shù)據(jù)均通過 IBM SPSS Statistics 25 和 Origin 2018 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖。

2 結(jié)果與討論

人體攝入的磷元素主要以無機鹽形式在腸道被 吸收，濃度約為 20 mmol /L 。為了模擬大豆肽鈣 螯合物在人體內(nèi)的穩(wěn)定性，并為后續(xù)分析大豆肽鈣 螯合物的性質(zhì)提供依據(jù)，研究了大豆肽鈣螯合物在 不同濃度的 PBS 溶液中的鈣保留率。77． 85% 的大豆肽相對分子質(zhì)量小 于 1 kDa，超過 50% 的大豆肽相對分子質(zhì)量小于 0． 5 kDa。與大豆肽相比，81． 81% 的螯合肽相對分子質(zhì) 量小于 1 kDa，有顯著提高。而相對分子質(zhì)量在 1 ～ 3 kDa 的螯合肽占比減少，處于 3 ～ 5 kDa 的螯合肽 則有所增加，表明與鈣離子螯合能力較強的大豆肽 相對分子質(zhì)量主要集中在小于 1 kDa。與螯合肽相 比，大豆肽鈣螯合物的相對分子質(zhì)量則明顯向高相 對分子質(zhì)量范圍遷移，如相對分子質(zhì)量處于 5 ～ 10 kDa 的占比提高了 11． 07 個百分點，處于 3 ～ 5 kDa 的占比提高了 6． 28 個百分點，處于 1 ～ 3 kDa 的占 比提高了 13． 75 個百分點，而小于 1 kDa 的相對分 子質(zhì)量占比有明顯的下降，表明大豆肽鈣螯合物具 有更高的相對分子質(zhì)量。

3 結(jié) 論

大豆肽在水解 4 h 條件下，水解度可達(dá) 19. 84%， 大豆肽與鈣離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，鈣結(jié)合量為 53． 03 mg /g，且制備的大豆肽鈣螯合物在低濃度磷酸鹽存 在時仍具有良好的穩(wěn)定性，在磷酸鹽緩沖液濃度為 10 mmol /L 時，鈣保留率為 74． 5%，20 mmol /L 磷酸 鹽緩沖液中鈣保留率為 62． 17% 。具有較高螯合能 力的大豆肽的相對分子質(zhì)量主要集中在小于 1 kDa 的范圍內(nèi)。谷氨酸和天冬氨酸是參與大豆肽鈣螯合 反應(yīng)重要的氨基酸。大豆肽鈣螯合物在各 pH 條件 下均沒有發(fā)生明顯的解離現(xiàn)象，表明其在不同 pH 條件下均具有較好的穩(wěn)定性。Zeta 電位分析表明， 大豆肽與鈣離子發(fā)生反應(yīng)后，其表面的電負(fù)性有顯 著的下降。大豆肽鈣螯合物在 XＲD 圖譜中的衍射 峰有所收窄，且氯化鈣的特征峰消失，表明大豆肽與 鈣離子形成了新的化合物。對大豆肽及大豆肽鈣螯合物的 DSC 分析和 TGA 分析表明，大豆肽與鈣離 子發(fā)生螯合反應(yīng)后，生成的大豆肽鈣螯合物具有比 大豆肽更好的熱穩(wěn)定性。