小柴胡湯對(duì)CFA大鼠踝關(guān)節(jié)組織影響分析?。?！

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種炎癥性疾病，以多關(guān) 節(jié)性、對(duì)稱(chēng)性、侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)，其特 點(diǎn)是關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨、骨和關(guān)節(jié) 周?chē)Y(jié)構(gòu)的逐漸破壞，導(dǎo)致殘疾。RANKL/RANK/ OPG 信號(hào)通路參與 RA 軟骨和骨的破壞的基本進(jìn)程， 調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化、成熟乃至凋亡，在 RA 骨破壞 中起到重要作用 。目前仍沒(méi)有完全有效的藥物控制 RA 的臨床癥狀。但是隨著免疫學(xué)、生物學(xué)和細(xì)胞 分子學(xué)的發(fā)展，而加之近年來(lái)的比較成熟 RA 動(dòng)物模 型的相繼建立，為研究 RA 的發(fā)病機(jī)制及其臨床的治 療提供了一定的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于 中醫(yī)痹病范疇?！端貑?wèn)直解·痹論》中記載：“痹， 閉也，血?dú)饽凉恍幸?rdquo;。引起痹病病因各異，但 病機(jī)為氣機(jī)阻滯，氣血運(yùn)行不暢，與“少陽(yáng)主骨”功 能失調(diào) ，少陽(yáng)樞機(jī)不利密切相關(guān)，可以應(yīng)用少陽(yáng)病 代表方劑小柴胡湯治療。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)健康雌性 Wistar 大鼠（遼寧長(zhǎng)生生 物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)，許可證號(hào)：SCXK（遼）2015- 001，5 ～ 6 月齡，體質(zhì)量 180 ～ 220 g，60 只，自由 攝食與飲水，均飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中 心 SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室 301 室 [ 實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)： SYYK（遼）2013-0009]。實(shí)驗(yàn)室溫度控制在（22±2）℃， 實(shí)驗(yàn)室濕度控制在（45±5）%，自然光照周期。

1.2 藥物

中藥飲片均一次性購(gòu)買(mǎi)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院藥局。小柴胡湯處方：柴胡 15 g，黃芩 9 g， 黨參 9 g，姜半夏 9 g，炙甘草 9 g，生姜 9 g，大棗 6 g， 煎煮濃縮，4 ℃保存?zhèn)溆?。雷公藤多苷片懸液：雷公藤多苷片?gòu)于上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)： 國(guó)藥準(zhǔn)字 Z1020415，產(chǎn)品批號(hào)：160302，10 mg/ 片， 加入蒸餾水?dāng)嚢瓒伞?按人與大鼠體表面積比換算給 藥等效劑量，成人與大鼠的折算系數(shù)為 6.3。小柴胡 湯藥材總重量 66 g，按 70 kg 成人每日 1 付藥，雷公藤 多苷片按說(shuō)明書(shū)正常成人用量 1 mg/kg。

1.3 主要試劑與儀器

牛Ⅱ型膠原（170157）（美 國(guó) Chondrex 公司），完全弗氏佐劑（170126）（美國(guó) Chondrex 公司），甲醇（20130827）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué) 試劑有限公司），無(wú)水乙醇（20131009）（國(guó)藥集團(tuán) 化學(xué)試劑有限公司），異丙醇（HG/T2892-2010）（天 津博迪化工股份有限公司），DEPC水（57F001100）（北 京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司），EnoGeneTM BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（E1WP201）（南京恩晶生 物科技有限公司），Qiagen RT2 First Strand kit（330401）[德 國(guó)凱杰（上海）有限公司 ]，Qiagen RT2 SYBR Green ROX qPCR kit（330522）[ 德國(guó)凱杰（上海）有限公 司 ]，Veriti 型梯度 PCR 儀（美國(guó)，生命技術(shù)公司）， 7500 型實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（美國(guó)，生命技術(shù)公司）， BSA223S-CW 型電子天平（德國(guó)，賽多利斯集團(tuán)）， Nano2000 型超微量紫外分光光度計(jì)（德國(guó)，賽默飛世爾有限公司），Stratos型臺(tái)式多功能冷凍高速離心機(jī)（德 國(guó)，賽默飛世爾有限公司），MK-20 干式恒溫箱（杭 州奧盛儀器有限公司），BL100 型雪花制冰機(jī)（上海 比朗儀器有限公司），QYC-2102C 型全溫?fù)u床（上海 ?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），SHZ-88 型水浴恒溫振蕩器 （海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及造模

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 4 d 后，根據(jù) 隨機(jī)數(shù)字表分成正常組 10 只，模型組 50 只，于大鼠 右腳跖趾墊處注射，其中正常組生理鹽水 0.2 mL/ 只， 模型組完全弗氏佐劑與牛Ⅱ型膠原蛋白（等體積冰上 混勻）乳狀注射液 0.2 mL/ 只。造模 7 d 后，正常組大 鼠關(guān)節(jié)無(wú)變化，模型組大鼠右足腫脹明顯，活動(dòng)受限， 并見(jiàn)到對(duì)側(cè)非注射部位關(guān)節(jié)腫脹，部分動(dòng)物出現(xiàn)耳、 尾部出現(xiàn)結(jié)節(jié)，全部模型造模成功。將成功造模的大 鼠根據(jù)體質(zhì)量分層，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為5組：模型組、XCHT 低劑量組、XCHT 中劑量組、XCHT 高劑量組、 雷公藤多苷組，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)大鼠死亡。

1.5 藥品干預(yù)方案

各組于造模后 7 d 開(kāi)始灌胃給藥， 正常組及模型組均予注射用水，小柴胡湯（Xiao Chai Hu Tang, XCHT）低劑量組（生藥含量為 0.198 g/mL）， XCHT 中劑量組（生藥含量為 0.396 g/mL），XCHT 高 劑量組（生藥含量為 0.792 g/mL），分別取 2 mL/ 次， 灌胃 3 次 /d。連續(xù)給藥 28 d，之后處死取材。

1.6 取組織蛋白標(biāo)本

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取全部實(shí)驗(yàn)大鼠去皮 去肉的右后踝關(guān)節(jié)組織樣品投入液氮中，盡量剪碎，放 入圓底的微量離心管，稱(chēng)重，將組織于-80 ℃凍存，備用。

2 結(jié)果

由圖 1 可見(jiàn)，正常組：大鼠雙踝關(guān)節(jié)周?chē)浗M織 無(wú)腫脹，無(wú)骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)破壞。模型組：大鼠雙踝 關(guān)節(jié)周?chē)浗M織腫脹明顯，右踝較重，雙踝及跖趾關(guān) 節(jié)關(guān)節(jié)間隙不清，部分關(guān)節(jié)融合。XCHT 低劑量組： 大鼠雙踝關(guān)節(jié)周?chē)浗M織腫脹明顯，右踝較重，雙踝 及跖趾關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)間隙不清，部分關(guān)節(jié)融合。XCHT 中劑量組：大鼠雙踝關(guān)節(jié)周?chē)浗M織腫脹明顯，右踝較 重，雙踝及跖趾關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)間隙不清，部分關(guān)節(jié)融合。 XCHT 高劑量組：大鼠雙踝關(guān)節(jié)周?chē)浗M織腫脹明顯， 右踝較重；右踝及跖趾關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)間隙不清，部分關(guān)節(jié) 融合，但較中劑量組及低劑量組程度輕；左踝及跖趾 關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)間隙尚清，關(guān)節(jié)無(wú)融合。雷公藤多苷組：大鼠雙踝關(guān)節(jié)周?chē)浗M織腫脹明顯，右踝較重；右踝及 跖趾關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)間隙不清，部分關(guān)節(jié)融合，但較中劑量 組及低劑量組程度輕，與高劑量組相似；左踝及跖趾 關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)間隙尚清，關(guān)節(jié)無(wú)融合。

3 討論

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性自身免疫性 疾病，其特征是關(guān)節(jié)炎癥，最終導(dǎo)致軟骨和骨的破壞。病程小于 3 個(gè)月的早期 RA 患者的影像學(xué)研究 表明，部分患者早在發(fā)病幾周后可以檢測(cè)到骨侵蝕改變。有研究表明在達(dá)到臨床緩解的患者中， 高達(dá) 20% ～ 30% 的患者表現(xiàn)出漸進(jìn)性的關(guān)節(jié)侵蝕性 破壞。延緩甚至阻止軟骨和骨質(zhì)的破壞為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎治療的最終目標(biāo)之一。參與 RA 軟骨和骨的破壞的 基本進(jìn)程，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化、成熟乃至凋亡的最 重要信號(hào)通路之一是 RANKL/RANK/OPG 信號(hào)通路。 RANKL，源于滑膜組織，在破骨細(xì)胞的活化過(guò)程中有 著重要的作用，通過(guò)與其膜受體 RANK 結(jié)合后促進(jìn)破 骨細(xì)胞的活化來(lái)促進(jìn)軟骨和骨質(zhì)吸收。而 OPG 屬于腫 瘤壞死因子受體，是 RANK 的天然誘騙受體，能夠競(jìng) 爭(zhēng)性的結(jié)合 RANKL，抑制了 RANKL 與 RANK 的結(jié)合， 拮抗了 RANKL 的活化破骨細(xì)胞而促進(jìn)軟骨和骨質(zhì)吸收功能。