QL-902在博來霉素誘導肺纖維化大鼠分析的使用

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（ idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是指慢性、進行性、原因不明的肺間 質(zhì)性纖維化病變，其發(fā)病率為 10～15 人/10 萬人，呈 明顯增長趨勢，缺乏有效的治療手段、預后差。 迄今多項研究表明，Wnt/β-catenin 信號通路對組織系 統(tǒng)的生理、病理起著至關(guān)重要的作用，包括胚胎形成、 細胞增殖、細胞分化、血管生成及癌癥形成等。

清潔級雄性 Wistar 大鼠 120 只，體質(zhì)量（200± 20）g，購自北京維通利華動物公司，動物許可證號 SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東方 醫(yī)院實驗中心清潔級動物房。

肺纖方（黃芪 15 g，紅景天 15 g，冬蟲夏草 3 g， 炙麻黃 6 g，水蛭 5 g，白果 10 g，瓜蔞 20 g，甘遂 2 g， 海蛤殼 30 g），飲片由北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院中藥 房提供，常規(guī)煎制，按每 100 g 體質(zhì)量給藥 1 mL 的 標準制備藥液。注射用博來霉素，浙江海正藥業(yè)股份 有限公司，15 mg/支，批號 16037911；醋酸潑尼松片， 天津力生制藥股份有限公司，5 mg/片，批號 1703035。

TRNzol 總 RNA 提取試劑，天根生化科技有限公 司，批號 DP405-02；RIPA 總蛋白提取試劑盒，美國 Sigma 公司，批號 Cat No.R0278；PMSF，美國 Sigma 公司，批號 Cat No. PMSF-RO；GAPDH 鼠單抗，天 津銳爾康生物科技有限公司，批號 Cat No.REK0005； 抗 wnt3a 抗體，美國 Thermo 公司，批號 Cat PA5-44946；抗 β-catenin 抗體，美國 CST 公司，批 號 Cat 8480；抗 WIF1 抗體，美國 Abcam 公司，批號 Cat ab155101；ECL，德國 Millipore 公司，批號 Cat No.WBKLS0500。超聲粉碎機（浙江三門超聲波儀器 廠），全自動顯微攝像系統(tǒng)（日本 Olympus 公司），渦 旋振蕩儀（型號 QL-902，海門市其林貝爾儀器制造有限公司），離心機（美國 Eppendorf 公司），分光光度計、酶標儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國 Thermo 公司）， 凝膠成像系統(tǒng)（型號 Tanon 1600，上海天能科技有限 公司），熒光定量 PCR 儀（型號 ABI7500，Applied Biosystems）。

實驗大鼠常規(guī)飼養(yǎng) 7 d 后，按隨機數(shù)字表分為假 手術(shù)組、模型組、潑尼松組和肺纖方高、中、低劑量 組，每組 20 只。采用博來霉素氣管插管復制肺纖維化模型。 大鼠腹腔注射 1%戊巴比妥鈉（45 mg/kg 體質(zhì)量）麻 醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上，經(jīng)氣管插入 18 號大鼠 導管。假手術(shù)組一次性氣管內(nèi)注入生理鹽水 1 mL/kg 體質(zhì)量，其余組以 3 mg/kg 注入博來霉素，隨即注入 空氣 0.3 mL，完畢后立即將大鼠直立、旋轉(zhuǎn)，清醒后 正常攝食飲水。大鼠造模次日開始常規(guī)灌胃給藥，每日 1 次。按 1 mL/100 g 體質(zhì)量給藥標準配制藥液。肺纖方高、中、 低劑量組給藥劑量依次為 19.8、9.9、4.95 g/kg 體質(zhì)量， 分別為成人臨床用藥的 2、1、0.5 倍，每周稱重，根 據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量；潑尼松組給予潑尼松藥液 4.2 mg/kg；模型組和假手術(shù)組給予等體積生理鹽水。 給藥至取材前 1 d。取大鼠肺組織 100 mg，裂解，離心，收集上清液， 提取組織總蛋白。待檢測蛋白樣品上樣 10 μg/孔；蛋 白電泳；轉(zhuǎn)膜至 0.45 μm 孔徑的 NC 膜，轉(zhuǎn)膜 1 h；封 閉；抗體孵育；洗膜；使用 ECL 發(fā)光試劑盒檢測肺 組織 wnt3a、β-catenin、WIF1 的蛋白表達。其中 wnt3a 稀釋比例為 1∶1000，β-catenin 稀釋比例為 1∶1000， WIF1 稀釋比例為 1∶2000，GAPDH 稀釋比例為 1∶ 10 000。使用 Image J 軟件對目的條帶行灰度分析， 計算目的蛋白相對表達量（目的蛋白灰度值／ GAPDH 灰度值）。

海門市其林貝爾通過分析得出IPF是慢性，進行性和病因不明的間質(zhì)性肺疾病，治療效果欠佳。目前尚無特異性的治療藥物，糖皮質(zhì)激素主要用于肺纖維化急性加重期；吡非尼酮和尼達尼布已經(jīng)被批準用于治療肺纖維化。

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