微量振蕩器在類酶聯(lián)免疫分析法中的分析

多環(huán)芳烴( Polycyclic Aromatic Hydrocarbons， PAHs) ，是一大類廣泛存在于環(huán)境中的持久性有機 污染物，主要來源是各種礦物燃料及其他有機物 的不完全燃燒和熱解過程。據(jù)報道，PAHs 本身沒 有急性毒性且不具有直接致癌性，但多環(huán)芳烴 的代謝物具有結(jié)合細(xì)胞蛋白質(zhì)和 DNA 的能力，因 此多環(huán)芳烴可以誘導(dǎo) DNA 損傷，從而具有較高的 毒性: 有害的生物效應(yīng)、毒性、致突變性和致癌性， 同時也可以作為共致癌物或腫瘤促進劑。目前， 已發(fā)現(xiàn) 400 多種多環(huán)芳烴及其衍生物可以誘導(dǎo)人體 產(chǎn)生癌癥。多環(huán)芳烴具有半揮發(fā)性，且隨分子量 增加蒸氣壓降低，多環(huán)芳烴也就越容易揮發(fā)。可以 蒸汽形式，借助吸附于顆粒物來實現(xiàn)在大氣環(huán)境中遠(yuǎn)距離的遷移，從而造成全球環(huán)境的極大污染。 目前，美國環(huán)保局和我國分別將其中的 16 種類別和 7 種類別的 PAHs 確定為優(yōu)先控制污染物。PAHs 分布 廣 泛，在 土 壤、水 體、食品和空氣中均有發(fā) 現(xiàn)。因此，多環(huán)芳烴長期以來受到全世界各國的 關(guān)注，一直是國內(nèi)外研究的環(huán)境污染物中的熱點和重要課題。

1) 包被緩沖液: 0. 05 mol /L 碳酸鹽緩沖液。 準(zhǔn)確稱取 NaHCO3 2. 93 g、Na2CO3 1. 59 g，加蒸 餾水?dāng)嚢枞芙猓詈蠖ㄈ萦?1 000 mL 容量瓶。用 1 mol / L HCl 和 1 mol /L NaOH 調(diào)節(jié)溶液 pH 值至 7. 4。 2) 洗滌液( PBS-T) 。

3) 封閉液( 1% 明膠) 。 準(zhǔn)確稱取明膠 1 g，用 0. 01 mol /L PBS ( pH = 7. 4) 經(jīng)磁力攪拌溶解并定容于 100 mL 容量瓶。

4) 底物緩沖液。 A 液: 準(zhǔn)確稱取檸檬酸 2. 1 g，加入蒸餾水溶解， 定容于 100 mL 容量瓶。 B 液: 準(zhǔn)確稱取 Na2HPO4·12H2O 7. 664 g，加入 蒸餾水溶解，定容于 100 mL 容量瓶。 準(zhǔn)確量取 A 液 2. 43 mL，B 液 2. 57 mL 混合后， 加蒸餾水并定容于 10 mL 容 量 瓶，調(diào) 節(jié) pH 值 至 5. 0，該試劑需現(xiàn)用現(xiàn)配。

5) 顯色液。 準(zhǔn)確稱取 TMB 10 mg，加入 4 mL 乙醇溶解，制 備 TMB 儲存液，于 4 ℃ 避光保存。使用時，取 TMB 儲存液 0. 4 mL，底物緩沖液 10 mL 和 30% H2O2 10 μL，混合均勻，該試劑需現(xiàn)用現(xiàn)配。

6) 終止液: 2 mol /L H2 SO4 溶液。 準(zhǔn)確量取濃硫酸 22. 2 mL，加入蒸餾水稀釋，待 冷卻后定容于 200 mL 容量瓶． 丙酮( 色譜純) 、乙腈( 色譜純) 、萘( 99% ) 、菲 ( 95% ) 、乙醇( 色譜純) 、NaOH( 分析純) 、HCl( 分析 純) 等試劑均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司; 苊 ( 98% ) 、熒蒽( 98% ) 、芘( 97% ) 購于阿拉丁生物有 限公司; 酶標(biāo)蒽購于北京翰譜生物有限公司; 試驗所 用的水均為 AD-SＲ05 超純水系統(tǒng)所制備。

EL800-PC 酶標(biāo)儀，美國 BIO-TEK 公司; 96 孔酶 標(biāo)板，生工生物有限公司; BSD-100 恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠; BCD-208K /A CJN 冷藏冷凍箱，青島海爾股份有限公司; MH-I 型微量 振蕩器，海門其林貝爾儀器制造有限公司; 8 道可調(diào) 移液器，Eppendorf; QP2010ΜLtra 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián) 用儀，島津企業(yè)管理中國有限公司; UltiMate3000 高 效液相色譜儀( 配備紫外檢測器) ，賽默飛世爾科技 中國有限公司。

將芳香烴受體蛋白用碳酸鹽緩沖液( pH = 7. 4) 按體積比 1∶ 200、1∶ 400、1∶ 600、1∶ 800、1∶ 1 000、1 ∶ 2 000 和 1∶ 3 000 稀釋，然后向 96 孔酶標(biāo)板中每孔 加入 100 μL 溶液，于 4 ℃條件下包被過夜 12 h。倒 出孔內(nèi)液體，用洗滌液 PBS-T 振蕩洗滌 3 次，每次 3 min，濾紙上拍干; 每孔加 1% 明膠 200 μL，于 37 ℃ 封閉反應(yīng) 60 min，倒出孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌的步驟， 濾紙上拍干。將酶標(biāo)蒽用 PBS 按體積比 1 ∶ 400、 1∶ 800、1∶ 1 000、1∶ 1 600、1∶ 2 000 和 1∶ 3 000、1∶ 4 000、 1∶ 5 000稀釋，每孔加入 100 μL，重復(fù)上述試驗操作步 驟，同時設(shè)置蒸餾水做空白對照，于37 ℃溫育6 min; 重 復(fù)洗滌的步驟，濾紙上拍干; 每孔加入 TMB 底物溶液 100 μL，室溫下顯色反應(yīng) 40 min，之后每孔加入 50 μL 終止液終止反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀于450 nm 處測定 OD 值。

在上述優(yōu)選工作條件下，測定不同質(zhì)量濃度多 環(huán)芳烴對酶標(biāo)蒽與蛋白結(jié)合的抑制率。具體操作步 驟: 配制質(zhì)量濃度梯度為 0、1 ng /mL、5 ng /mL、10 ng /mL、50 ng /mL、100 ng /mL 的系列多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn) 液，分別取 10 μL 標(biāo)準(zhǔn)液與酶標(biāo)蒽混合，按照上述步 驟操作，用酶標(biāo)儀檢測 OD450 的值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線，計算 80% 抑制率的多環(huán)芳烴質(zhì)量濃度為最低有 效檢測質(zhì)量濃度。 將 1 ng /mL、5 ng /mL 水平分別加標(biāo)至 5 ng /mL 和 10 ng /mL，用 ELISA 重復(fù)檢測 5 次，計算重復(fù)性 和加標(biāo)回收率。

色譜 柱 為 ODS-3 柱 ( 250 mm × 4. 6 mm × 5 μm) ，等度洗脫，V( 乙腈) ∶ V( 蒸餾水) = 80∶ 20，進樣 量 20 μL，流速為 1. 2 mL /min，紫外檢測波長為 232 nm，柱溫為 30 ℃。

色譜柱為 DB-5ms 柱( 30 m × 0. 25 mm × 0. 25 μm) ，進樣口溫度為280 ℃，不分流，進樣量1 μL，柱 流量 1. 0 mL /min，柱 溫 80 ℃ 保 持 2 min，以 20 ℃ /min 速率升至180 ℃，保持5 min，再以10 ℃ /min 速率升至 290 ℃，保持 5 min。

由于配體受體結(jié)合過程是動態(tài)平衡，結(jié)合形成 的復(fù)合物可在一定條件下解離。配體和受體質(zhì)量濃 度比例合適時，結(jié)合能力最大，產(chǎn)生的復(fù)合物最多、 反應(yīng)速度最快。配體受體結(jié)合是可以達(dá)到飽和的， 因此當(dāng)兩者比例未達(dá)到合適范圍時，復(fù)合物的產(chǎn)量 降低，反應(yīng)速度下降，甚至不發(fā)生反應(yīng)。試驗中采用方陣滴定法可在較大的范圍內(nèi)顯示 出芳香烴受體蛋白和酶標(biāo)蒽的工作質(zhì)量濃度情況， 結(jié)果見圖 1。從圖 1 可見當(dāng)芳香烴受體蛋白的稀釋 倍數(shù)為 2 000，酶標(biāo)蒽的稀釋倍數(shù)為 400 時，吸收值 達(dá)到峰值( 0. 436) 。因此選擇此稀釋倍數(shù)為芳香烴 受體蛋白和酶標(biāo)蒽的最適合質(zhì)量濃度組合。配制質(zhì)量濃度分別為 0、0. 1 μg /mL、1 μg /mL、5 μg /mL、10 μg /mL、50 μg /mL、100 μg /mL 的多環(huán)芳 烴標(biāo)準(zhǔn)溶液，按 1. 2. 3 的液相色譜條件，對 5 種多環(huán) 芳烴的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣 20 μL 進行測定。以峰 面積( S) 對化合物質(zhì)量濃度( ρ) 求得線性回歸方程， 計算相關(guān)性；

1) 試驗表明，建立的芳香烴受體介導(dǎo)的類酶聯(lián) 免疫分析法的檢出限、準(zhǔn)確度和重復(fù)性均符合標(biāo)準(zhǔn)。 因此本文所建立的類酶聯(lián)免疫方法具有可行性，適 用于多環(huán)芳烴類物質(zhì)的檢測。

2) 與 HPLC 和 GC /MS 法比較后發(fā)現(xiàn)，類 ELISA 法檢測快速、便捷，可以同時檢測多個樣品，且成本 較低; GC /MS 法重復(fù)性性好，定量準(zhǔn)確，但類 ELISA 的檢出限較低，靈敏度更好。

3) 在日常檢測工作中，可根據(jù)樣品量和檢測需 求等選擇檢驗方法，當(dāng)樣品量較大時可先用 ELISA 法初篩樣品中是否含有多環(huán)芳烴，如需檢測某種多 環(huán)芳烴的含量則使用 GC /MS 檢測定量。