其林貝爾用紫外分析儀度二氫查耳烷環(huán)合型三聚

中藥活性成分的高效分離與結(jié)構(gòu)鑒定為中藥化 學(xué)生物學(xué)的重要組成部分，從傳統(tǒng)名貴、療效確切的 中藥中快速發(fā)現(xiàn)活性成分對(duì)于闡明藥效物質(zhì)及其作用機(jī)制具有重要意義。龍血竭是傳統(tǒng)名貴藥材血竭 的代用品，其功效與血竭基本一致，具活血散瘀、定 痛止血、斂瘡生肌之功效。龍血竭基原植物百合科龍血樹(shù)屬植物劍葉龍血樹(shù) Dracaena cochinchinensis 主要分布在東南亞各國(guó)以及我國(guó)云南、廣西等地。 現(xiàn)代藥理研究表明龍血竭總提物及單體成分具有腦 缺血保護(hù)、心肌保護(hù)、抗動(dòng)脈粥樣硬化等廣泛的藥理 活性。

高效液相-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀( 日本島津 公司) ; Varian INOVA-500M 核磁共振儀( 美國(guó) Varian 公司) ; UV-2450 紫外-可見(jiàn)分光光度儀( 日本島 津公司) ; Nexus 470 FT-IＲ 傅立葉變換紅外光譜儀， KBr 壓片( 美國(guó)熱點(diǎn)尼高力公司) ; Autopol Ⅳ全自動(dòng) 旋光測(cè)定儀( 美國(guó)魯?shù)婪蚬? ; JASCO 815 圓二色 譜測(cè)定儀( 日本光電株式會(huì)社) ; Milli Q 超純水機(jī) ( 美國(guó) Millipore 公司) ; F-1 型三用紫外分析儀( 江蘇 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司) ; DZF-6090 真 空干燥箱( 上海申賢恒溫設(shè)備廠) ; 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀( 瑞 士步琦公司) ; DLSB-5/20 低溫冷卻液循環(huán)泵( 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司) ; Buchi C-620 中壓制備液相 色譜儀( 瑞士步琦公司) ; 半制備型高效液相色譜儀 ( 日本島津公司) ; YMC-Pack ODS-A 半制備高效液 相色譜柱( 10 mm × 250 mm，5 μm) ; ODS C18 ( 40 ～ 63 μm，德國(guó) Merck 公司) ; 薄層色譜 GF254硅膠預(yù)制 板和柱色譜硅膠( 200 ～ 300 目) 均為青島海洋化工 廠生產(chǎn)。提取分離所用甲醇、乙酸乙酯、石油醚等溶 劑為北京化工廠生產(chǎn)，均為分析純。高效液相所用 溶劑如甲醇、乙腈等為色譜純，水為超純水。 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞 ＲAW264. 7( 北 京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心) ; 超凈工 作臺(tái)( 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司) ; CO2 培養(yǎng)箱 ( 日本三洋電機(jī)國(guó)際貿(mào)易有限公司) ; 倒置生物顯微 鏡( 廈門(mén)麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司) ; 多功能酶標(biāo) 儀( 美國(guó) PerkinElmer 公司) 。陽(yáng)性藥吲哚美辛( 美 國(guó) Sigma-Aldrich 公司) ; 龍血竭各萃取部位( DMSO 溶解，質(zhì)量濃度 25. 0 g·L－1 ) 、化合物 1 和 2( DMSO 溶解，濃度 25. 0 mmol·L－1 ) 。 龍血竭購(gòu)買(mǎi)于廣西中醫(yī)學(xué)院制藥廠 ( 批 號(hào) 20120404) ，為劍葉龍血樹(shù) D． cochinchinensis 含脂木 材的乙醇提取物，標(biāo)本存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥 學(xué)院中藥現(xiàn)代研究中心。

龍血竭成品 950 g，依次用石油醚、 乙酸乙酯回流提取( 8 L×3，每次 2 h) ，合并提取液， 減壓回收溶劑，得到石油醚提取物 65 g、乙酸乙酯提 取物 600 g、藥渣 265 g。龍血竭乙酸乙酯提取物 600 g，經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚-乙酸乙酯( 10 ∶ 1 ～ 1 ∶3) 、二氯甲烷-甲醇( 20 ∶ 1 ～ 0 ∶ 1) 洗脫，得到 15 個(gè)流分( Fr． A ～ O) 。LC-MS 分析發(fā)現(xiàn) Fr． H 為黃酮 寡聚體( 相對(duì)分子質(zhì)量大于 500) 的富集部位。Fr． H( 128 g) 經(jīng)過(guò)硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯 ( 3 ∶1 ～ 0 ∶1) 洗脫，得到 3 個(gè)流分( Fr． H1 ～ H3) 。Fr． H2 經(jīng)中壓制備液相分離( ODS 柱，50 mL·min－1 ， 50% ～ 100% MeOH) 得到 5 個(gè)流分( Fr． H2a ～ H2e) 。 Fr． H2b 經(jīng)半制備液相( 甲醇-水 45 ∶ 55) 純化，得到 化合物 1( 10. 5 mg，tＲ 63. 5 min) 。Fr． H2c 經(jīng)半制備 液相( 甲醇-水 58 ∶42) 純化，得到化合物 2( 8. 2 mg， tＲ 38. 3 min) 。

測(cè)試條件 Agilent ZOＲBAX SB-C18色 譜柱( 4. 6 mm×250 mm，5 μm) ，流動(dòng)相為水( 0. 1% 甲酸) ( A) 和乙腈( B) ，梯度洗脫條件如下: 0 ～ 30min，5% ～ 95% B; 流速 1 mL·min－1 。質(zhì)譜分析在正 負(fù)離子模式下測(cè)定，ESI 作為離子源，檢測(cè)電壓 1. 40 kV，飛行時(shí)間區(qū)域( TOF) 壓力 1. 5×10－4 Pa; 離子阱 區(qū)域( IT) 壓力 1. 9×10－2 Pa; 干燥氣壓力 100. 0 kPa; 霧化氣流速 1. 5 L·min－1 ; 曲線(xiàn)脫溶劑系統(tǒng)( CDL) 溫 度 200 ℃ ; 掃描范圍 m / z 100 ～ 1 500。

ＲAW264. 7 細(xì)胞釋放 NO 活性篩選 活性測(cè)試在 LPS 刺激的 ＲAW264. 7 細(xì)胞 NO 釋放 模型 上 完 成，具體實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)。 ＲAW264. 7 細(xì)胞用 DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液( 含 10% FBS 與 1%青-鏈霉素雙抗液) 置于 37 ℃，5%CO2 環(huán)境下 濕化培養(yǎng)。細(xì)胞以 2×104 個(gè)/mL 接種于 96 孔細(xì)胞 培養(yǎng)板后，于 37 ℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，用 不同濃度待測(cè)萃取部位( 5，50 mg·L－1 ) 、單體化合物 ( 4，20，100 μmol·L－1 ) 作用于 ＲAW264. 7 細(xì)胞 1 h 后，加入終質(zhì)量濃度 0. 5 mg·L－1 的 LPS，24 h 后， MTT 方法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，NO 檢測(cè)試劑盒檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)液中 NO 濃度，并計(jì)算龍血竭各萃取部位 和單體化合物在沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制濃度下對(duì) NO 分 泌的抑制率。陽(yáng)性藥為吲哚美辛。

利 用 LPS 刺 激 的 ＲAW264. 7 細(xì)胞 NO 釋放模型測(cè)定龍血竭總提物、 乙酸乙酯部位、石油醚部位的潛在抗炎活性，結(jié)果表 明在低質(zhì)量濃度( 5 mg·L－1 ) 下，上述部位的 NO 抑 制率分 別 為 ( 3. 9 ± 9. 9) %，( 1. 6 ± 9. 8) %，( 7. 8 ± 4. 8) %，且無(wú)明顯的細(xì)胞毒作用; 在高質(zhì)量濃度( 50 mg·L－1 ) 下，龍血竭乙酸乙酯部位、石油醚部位的 NO 抑制率分別為( 25. 5±4. 5) %，( 5. 6±6. 00) %，無(wú) 明顯的細(xì)胞毒作用; 龍血竭總提物顯示出細(xì)胞毒作 用，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)( 31. 7±1. 5) %。龍血竭乙酸 乙酯部位較石油醚部位呈現(xiàn)出更好的抑制 NO 釋放 活性，因此對(duì)活性較好的乙酸乙酯部位進(jìn)一步分離。

經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)調(diào) 研發(fā)現(xiàn)，龍血竭中簡(jiǎn)單黃酮相對(duì)分子質(zhì)量主要集中 在 250 ～ 350，黃酮二聚體相對(duì)分子質(zhì)量在 450 ～ 650， 黃酮三聚體的相對(duì)分子質(zhì)量在 700 ～ 800。為了得到 結(jié)構(gòu)新穎的黃酮寡聚體成分，對(duì)龍血竭乙酸乙酯部 位經(jīng)硅膠柱分離得到的 15 個(gè)流分進(jìn)行 LC-MS 分 析。從 MS1 圖譜中可以發(fā)現(xiàn) Fr． H 中主要色譜峰的 準(zhǔn)分子離子峰信號(hào)位于 m /z 500 ～ 800，由此判斷該 流分富含黃酮寡聚體類(lèi)成分。Fr． H 經(jīng)硅膠柱分離得到的各個(gè)流分進(jìn)一步行 LC-MS 分析，其中 Fr． H2 色譜圖呈現(xiàn) 2 個(gè)主要色譜峰，負(fù)離子模式下顯示準(zhǔn) 分子離子峰分別為 799. 315 0( ［M + HCOO］－ ) 和 767. 319 1( ［M－H］－ ) ，結(jié)合二級(jí)碎片離子推測(cè)其為 黃酮三聚體類(lèi)成分。選取這 2 個(gè)信號(hào)其為目標(biāo)化合 物，進(jìn)行導(dǎo)向性分離。采用 LC-MS 追蹤，進(jìn)一步發(fā) 現(xiàn)流分 Fr． H2b，F(xiàn)r． H2c 中分布有目標(biāo)化合物，行半 制備液相分離純化目標(biāo)成分。

本文首次利用活性追蹤并結(jié)合 LC-MS 分析的 方法，從龍血竭中快速識(shí)別、分離得到了 2 個(gè)黃酮三 聚體化合物。其中，化合物 1 為新化合物，化合物 2 為首次從該種植物中分離得到。本文是首次發(fā)現(xiàn)該 植物中存在二氫查耳烷環(huán)合型三聚體?；衔?1 和 2 能夠顯著地抑制 LPS 刺激的 ＲAW264. 7 細(xì)胞釋放 NO，具有潛在的抗炎作用。本研究為龍血竭藥效物 質(zhì)的闡明和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。