手掌離心機(jī)在蜂蜜樣本中氯霉素殘留量分析中的

氯霉素是一種對(duì)革蘭氏陰性菌以及陽(yáng)性菌都 有很好抑制作用的抗生素，曾經(jīng)對(duì)畜禽疾病的控 制和治療起到了特別重要的作用。由于氯霉素藥 性比較穩(wěn)定而且價(jià)格比較便宜，在養(yǎng)蜂業(yè)中經(jīng)常 會(huì)使用氯霉素，用于防止蜜蜂爬蜂病，因此蜂蜜 中可能含有氯霉素殘留。如果大量食用含有氯霉 素殘留的食物會(huì)使人產(chǎn)生耐藥菌株，而且會(huì)破壞 人體內(nèi)正常菌群的平衡狀態(tài)。氯霉素存在嚴(yán)重的 副作用，能引起人的再生障礙性貧血、粒細(xì)胞缺 乏癥等疾病。因此，美國(guó)規(guī)定在動(dòng)物性食品中不 得檢出氯霉素，歐共體不允許氯霉素用于產(chǎn)奶母 牛和產(chǎn)蛋雞。歐盟已明文規(guī)定了氯霉素等多種抗 生素藥物不再作為獸藥使用。國(guó)外對(duì)進(jìn)口蜂蜜中 氯霉素的殘留限量定在0.1 µg/kg。

抗生素殘留檢測(cè)方法目前主要有微生物法、 理化檢測(cè)法、免疫分析法。微生物法存在 操作時(shí)間長(zhǎng)、結(jié)果偏差大等缺點(diǎn)，很難定量檢 測(cè)。理化檢測(cè)法需要昂貴的檢測(cè)儀器及專業(yè)的操 作技能，結(jié)果準(zhǔn)確，常作為最終確證的方法。色 譜或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是目前比較成熟而且可以 投入到實(shí)際操作的抗生素檢測(cè)技術(shù)，優(yōu)點(diǎn)是靈敏 度較高、分辨率高，可進(jìn)行定性和定量分析，同 時(shí)可檢測(cè)多個(gè)抗生素種類，但是由于前處理步驟 較多，費(fèi)時(shí)，而且需要大型儀器設(shè)備，所以很難 在一些小型的食品檢測(cè)企業(yè)或農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行推廣，僅 僅適用于檢驗(yàn)檢疫部門用來(lái)作為終判的方法。因 此，更加簡(jiǎn)單快速、低成本的分析檢測(cè)方法需要 被開(kāi)發(fā)出來(lái)以滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要。免疫分析法 具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、通量性高 等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為初篩的首選方法。免疫分析 法的基本原理是抗原或半抗原和抗體發(fā)生特異性 的免疫反應(yīng)，常用的方法包括試紙條法和酶聯(lián)免 疫吸附法。試紙條法簡(jiǎn)單快速，酶聯(lián)免疫吸附法 可以定量，但一次只能檢測(cè)一個(gè)指標(biāo)。

蛋白質(zhì)芯片方法又稱蛋白質(zhì)微陣列，是在基 因芯片之后發(fā)展起來(lái)的一種分析方法。其原理是 對(duì)固相載體進(jìn)行特殊的化學(xué)處理，再將已知的大 量蛋白(如酶、抗體、抗原、細(xì)胞因子等)有規(guī)律 地固定在上面，根據(jù)這些大分子蛋白的特點(diǎn)，捕 獲能與之特異性結(jié)合的待測(cè)蛋白(存在于血清、血 漿、淋巴、組織液等)，然后用芯片分析儀進(jìn)行掃 描，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)芯片方法在動(dòng)物源 性食品抗生素殘留的檢測(cè)方面應(yīng)用很廣泛。 蛋白芯片方法是一種高通量的檢測(cè)方法，能在一 次實(shí)驗(yàn)中提供大量的信息。靈敏度高，可以準(zhǔn)確 檢測(cè)出蛋白樣品中微量蛋白的含量，檢測(cè)水平已 達(dá)納克級(jí)，而且所需的樣品量少?？梢源蟠蠼档?檢測(cè)的成本，同時(shí)也提高了檢測(cè)的效率。目前， 蛋白芯片方法逐漸成為免疫分析方法的發(fā)展方向 之一，受到越來(lái)越廣泛地重視。

NaCl、KCl、NA2HPO4 .12H2O、KH2PO4、吐 溫20、乙二胺四乙酸(EDTA)：分析純，南京化學(xué) 試劑有限公司；牛血清白蛋白(BSA)：99%，w/w 美國(guó)默克公司；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；氯霉 素抗體、納米材料標(biāo)記的二抗、銀增強(qiáng)顯色溶液 (A液、B液)：南京祥中生物科技有限公司。 實(shí)驗(yàn)所用水均為18.25 MΩ/cm純凈水(Milli-Q 水凈化系統(tǒng))。10 mmol/L PBS(磷酸鹽緩沖液) pH7.2作為分析緩沖液。洗滌緩沖液PBS含0.05% 吐溫20(PBST)。封閉劑為1% BSA。所有緩沖液在使用前通過(guò)0.22 µm孔徑過(guò)濾器過(guò)濾。生物芯片點(diǎn)樣儀：清華大學(xué)；ELx50自動(dòng)洗板 機(jī)：美國(guó)biotech儀器有限公司；MD-200恒溫振蕩 儀Thermo-shaker、Qarray 2000芯片分析儀、96孔 板芯片載體：南京祥中生物科技有限公司；渦旋 混合器、Lx-100手掌型離心機(jī)：江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；單道可調(diào)移液器：百得 實(shí)驗(yàn)室儀器蘇州有限公司。

稱取10 mg氯霉素和丁 二酸酐溶于1 mL丙酮，振蕩反應(yīng)1.5 h。于40 ℃ 氮吹后，加入200 µL DMSO溶解殘留物，再分別 加入200 µL 5 mg/mL EDC和NHS溶液，振蕩反應(yīng) 2 h。再加入2 mL 5 mg/mL BSA溶液，振蕩反應(yīng)4 h，4 ℃下用1xPBS透析3 d，然后分裝，—20 ℃冷 凍保存?zhèn)溆谩?/span>

陽(yáng)性對(duì)照和制備得到的氯 霉素抗原溶液(CAP-BSA)用生物芯片點(diǎn)樣儀在96 孔板芯片底部制備陣列。共6個(gè)陣列點(diǎn)(2×3陣 列)，每個(gè)陣列點(diǎn)約40 nL，陣列間距約500 µm的 微陣列生物芯片，每個(gè)溶液重復(fù)3個(gè)陣列點(diǎn)。點(diǎn)樣 后，在37 ℃下孵育2 h。為了減少非特異性吸附， 固定后每孔加入200 µL 10 mg/mL BSA，在37 ℃ 封閉1 h。封閉后，生物芯片孔板用1×PBST緩沖 液洗板，拍干，然后用鋁箔袋密封存儲(chǔ)在2～8 ℃ 備用。

本論文采用的 是間接競(jìng)爭(zhēng)微陣列免疫分析原理，見(jiàn)圖1。在微 陣列免疫分析中，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)過(guò)程。每孔中 加入25 µL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，再加入已知量的25 µL 混合抗體，25 ℃振蕩反應(yīng)30 min(振蕩速度600 r/ min)。清洗后再加入50 µL AgNPS標(biāo)記的羊抗鼠 IgG，37 ℃振蕩反應(yīng)30 min(振蕩速度600 r/min)。 洗滌后再加入50 µL銀增強(qiáng)顯色溶液(包括溶液A和 溶液B)，在37 ℃中避光反應(yīng)12 min。顯色反應(yīng)結(jié)束后，再清洗3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 氯霉素抗原的紫外表征

氯霉素、BSA都有紫外吸收，但偶聯(lián)后的抗 原，由于共軛體系等的變化，使得其紫外吸收光 譜曲線和λmax都會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變。因此可以用來(lái)鑒定抗原是否偶聯(lián)成功。氯霉素的濃度為0.01 mol/L，BSA的濃度為1 mg/mL，紫外吸收光譜見(jiàn) 圖2。由圖2可知，氯霉素的最大吸收波長(zhǎng)為270 nm，BSA的最大吸收波長(zhǎng)為280 nm，偶聯(lián)后氯霉 素抗原的最大吸收波長(zhǎng)為276 nm，與氯霉素相比 最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生了紅移，說(shuō)明氯霉素抗原偶聯(lián) 成功。2.2 抗原、抗體和二抗?jié)舛葍?yōu)化 氯霉素抗原、抗體、二抗?jié)舛仁怯绊懜?jìng)爭(zhēng)性 免疫檢測(cè)靈敏度的主要因素，因此檢測(cè)前要對(duì)其 濃度進(jìn)行優(yōu)化。在本文中，氯霉素抗原濃度分 別為1:4，1:8，1:16稀釋；抗體分別為1:80000、 1:160000、1:240000、1:320000稀釋，二抗1:50、 1:100、1:200稀釋。 抗原抗體的濃度低，靈敏度高，但相對(duì)灰度 信號(hào)值(RLUs)也會(huì)降低。綜合兩者，選擇相對(duì)灰 度信號(hào)值在40000左右，確定最佳測(cè)定條件為： 氯霉素抗原最佳濃度為1:8，抗體最佳質(zhì)濃度均為 1:160000，二抗最佳濃度為1:100。

本論文開(kāi)發(fā)的蛋白芯片快速檢測(cè)方法具有操 作簡(jiǎn)單、高通量、快速低成本等特點(diǎn)。氯霉素的 檢出限是0.02 ng/mL，定量限為0.03 ng/mL。本方 法靈敏度高，同時(shí)也不需要復(fù)雜的樣品前處理。 因此，新開(kāi)發(fā)的蛋白芯片方法，具有良好的靈敏 度和簡(jiǎn)單的儀器設(shè)備，同時(shí)具有較低的檢出限和 較好的回收率。利用蛋白芯片法可以快速準(zhǔn)確測(cè) 定蜂蜜中的氯霉素殘留量，具有快速、并行性、 高通量的特點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模樣品的初篩。 在動(dòng)物源性食品殘留抗生素的含量檢測(cè)方面有廣 闊的發(fā)展前景。